[发明专利]透射光学显微镜的样品梯度照明方法和装置

说明书

技术领域

本发明属于显微成像领域，涉及一种增强显微镜成像对比度的成像方法。

背景技术

传统上来说，为了观察未经染色的标本和活细胞，增加显微镜成像对比度方面，目前有3种方法，分别是：

1．相差显微镜（Phase Contrast Microscopy），由荷兰科学家、诺贝尔奖获得者泽尔尼克于1935年发明。主要是利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅差，最后通过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测。虽然可以增加成像对比度，但是需要样品厚度很薄，所以并不适合多数的生物应用；

2．微分干涉显微镜（Differential Interference Contrast Microscopy），由波兰物理学家诺玛斯基于1952年在相差显微镜的基础上发明，与前者相比，其可以使用更厚的样品，而且成像的立体感更好，故目前得到了广泛应用；

3．倾斜式照明（Oblique illumination），为一种增加成像对比度的最简单方法。通常采用在聚光镜中加一个大小可调的狭缝，当光线在侧面入射时，可以将样品厚度和密度的不同，用光线的强弱来对比出来。虽然可以通过旋转狭缝来增加对比度，但却明显的降低了分辨率。

以上三种方法，用的最多的便是微分干涉显微镜，尤其在广泛使用的动物脑组织切片的电生理记录中。为了增加照明光线对脑组织的穿透性，提高成像深度，现在多采用了对生物组织穿透性更强的红外光来激发，但其缺点是：1.使用多个偏振器件，光路复杂，而且造价高；2.对比度不够高，而起光强度低；3.使用了偏振棱镜，使其无法和应用广泛的双光子显微镜光路相兼容。现有的微分干涉显微镜，必须在整个光路上放置起偏器，诺玛斯基棱镜与检偏器，造成使用上的不方便，尤其是其无法和双光子显微镜配套观察。

发明内容

技术问题：本发明提供了一种可方便用户利用透射光寻找样品、可即插即用的透射光学显微镜的样品梯度照明方法，以及实现该方法的透射光学显微镜的样品梯度照明装置。       

技术方案：本发明的透射光学显微镜的样品梯度照明方法，包括以下步骤：

1）在反射镜与红外光源之间的入射光路上放置焦距均为f的第一凸透镜和第二凸透镜，第一凸透镜和第二凸透镜的焦点位于两个凸透镜之间，反射镜设置在光学显微镜上聚光镜的入射光路一侧，用以将入射光反射进聚光镜，第一凸透镜位于临近红外光源一侧，第二凸透镜位于临近反射镜一侧，第一凸透镜与第二凸透镜的间距在f至2f之间；

2）调节红外光源与第一凸透镜的间距，直至红外光源通过第一凸透镜形成的共轭平面位于第二凸透镜的焦点处时，固定红外光源和第一凸透镜，在红外光源的共轭平面处放置空间滤波器，在空间滤波器与第一凸透镜焦点之间的光路上放置散射片，空间滤波器包括遮光部分和透光部分，透光部分位于空间滤波器的边缘；

3）保持红外光源、第一凸透镜、第二凸透镜、空间滤波器和散射片之间的位置关系，调节第二凸透镜与反射镜的间距，直至空间滤波器通过第二凸透镜和反射镜形成的共轭平面位于聚光镜的孔径平面上时，固定第二凸透镜；

4）再次调节红外光源与第一凸透镜的间距，直至红外光源通过第一凸透镜形成的共轭平面再次位于第二凸透镜的焦点处时，固定红外光源和第一凸透镜；

5）开启红外光源，围绕光路轴线旋转调节空间滤波器，观察不同位置样品的三维形态，沿光路轴线水平移动散射片，调节空间滤波器和散射片的间距，观察样品在不同距离下的对比度增强效果。    

本发明的实现上述方法的透射光学显微镜的样品梯度照明装置，包括壳体，以及设置于壳体内的、均位于同一轴线上的第一凸透镜、第二凸透镜、空间滤波器和散射片，第一凸透镜和第二凸透镜的焦点位于两个凸透镜之间且焦距均为f，空间滤波器包括遮光部分和透光部分，透光部分位于空间滤波器的边缘，空间滤波器位于第二凸透镜的焦点处，散射片位于空间滤波器和第一凸透镜焦点之间，空间滤波器能够围绕光路轴线旋转调节，散射片能够沿光路轴线水平移动调节。

本发明的透射光学显微镜的样品梯度照明装置中，空间滤波器连接有旋转调节装置，用以围绕光路轴线旋转调节空间滤波器，散射片连接有轴向调节装置，用以沿光路轴线水平移动调节散射片。

本发明的透射光学显微镜的样品梯度照明装置中，第一凸透镜和第二凸透镜的间距可以是能够调节的。

本发明通过光学元件的组合，将光通过样品后的不可见相位变化，转换成可见的光强度梯度变化。