[发明专利]运用核酸恒温扩增技术检测肺炎克雷伯菌的试剂及其扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及病原体检验技术，具体地说是运用核酸恒温扩增反应来检测肺炎克雷伯菌的技术。

背景技术

肺炎克雷伯菌为革兰阴性杆菌，病变中渗出液粘稠而重，致使叶间隙下坠。细菌具有荚膜，在肺泡内生长繁殖时，引起组织坏死、液化、形成单个或多发性脓肿。病变累及胸膜、心包时，可引起渗出性或脓性积液。病灶纤维组织增生活跃，易于机化；纤维素性胸腔积液可早期出现粘连。在院内感染的败血症中，肺炎克雷伯菌为重要病原菌，病死率较高。

肺炎克雷伯菌(KNP)是临床分离及医院感染的重要致病菌之一，随着β-内酰胺类及氨基糖苷类等广谱抗菌素的广泛使用，细菌易产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC酶)以及氨基糖苷类修饰酶(AMEs)，对常用药物包括第三代头孢菌素和氨基糖苷类呈现出严重的多重耐药性。肺炎克雷伯菌引起的医院感染率近期逐年增高，且多耐药性菌株的不断增加常导致临床抗菌药物治疗的失败和病程迁延。肺炎克雷伯菌耐药机制主要包括产生β-内酰胺酶、生物被膜的形成、外膜孔蛋白的缺失。抗菌药物主动外排等，抗菌药物耐药基因水平播散是多药耐药菌株临床加剧的重要原因。

因此能够快速有效的检测肺炎克雷伯菌对于与之相关的疾病防控具有重要的意义。

肺炎克雷伯菌的检测方法有常规培养和生理生化反应检测等多种方法，与传统检测手段相比，本发明很好的解决了目前大多数检测技术手段的弊端。首先，无需任何复杂的仪器，只需要一台简单的加热器，如普通的水浴锅或以电、电池为能源的加热器，使得核酸诊断可以前所未有地用于现场诊断。其次，可以加快反应速度，缩短反应时间。第三，易于操作者掌握，对反应条件的要求相对宽松，使得以该技术为基础的产品对操作人员的技能要求不高，这也为核酸试剂的普及创造了条件。

发明内容

针对肺炎克雷伯菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用等温扩增技术快速、便捷、低成本的试剂和检测方法。

本发明提供了更加快速和低成本通过等温扩增方法检测肺炎克雷伯菌的方法。本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)设计特异性寡核苷酸引物用于等温扩增技术检测；

(2)整合各引物使之不相互干扰。

(3)以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；

(4)扩增完毕后可通过使用商业化的核酸恒温扩增检测试纸条对扩怎产物进行检测，阳性结果呈现两条紫红色条带，阴性结果呈现一条紫红色条带。

该方法包括：应用该方法检测肺炎克雷伯菌所使用的引物组和与之配套的等温扩增反应条件。其中引物序列如下：

该引物序列参照GenBank中的序列AP006725.1 Klebsiella pneumoniaesubsp.pneumoniae NTUH-K2044DNA，complete genome中的溶质接合蛋白序列为基础进行设计。

引物：

SEQ ID NO.1：5’-TACGCCCCGGTCTGAC

SEQ ID NO.2：5’-GCGCTTTCACCCCCAAC

SEQ ID NO.3：5’-GTCCCTTTTGCCCGAGGTCGACGGCACGGCCATT

SEQ ID NO.4：5’-CGACGGCACGGCCATTTGTCCCTTTTGCCCGAGG

SEQ ID NO.5：5’-TGGCAACGACTGGTCTCGCC

SEQ ID NO.6：5’-TCGCGTAGGGGGAGGCTGTT。

其中序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6使用特殊基团标记，扩增产物中包含上述基团，以便同核酸恒温扩增检测试纸条反应。

本发明中反应体系中各组分构成比例如下：

其中Bs t酶缓冲液的成分为20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、10mM KCl、2mM MgSO4、质量百分比0.1％Triton X-100、10mM dNTP，且pH为8.8。

等温扩增程序为：61℃60分钟。

扩增完毕后可通过使用商业化的核酸恒温扩增检测试纸条对扩怎产物进行检测，阳性结果呈现两条紫红色条带(分别为检测线和质控线)，阴性结果呈现一条紫红色条带(质控线)。