[发明专利]EML4-ALK融合基因检测的PCR引物、试剂盒和液相芯片

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种EML4-ALK融合基因检测检测的PCR引物、试剂盒和液相芯片。 

技术背景

癌症中的染色体重排常常导致两个独立的基因融合在一起。在某些情况下，两个基因编码区连接在一起，导致融合蛋白的表达，称为基因融合（Gene fusions）。基因融合现象最早发现于多种血液和软组织癌症，如白血病、淋巴瘤等。2007年日本科学家首次在非小细胞肺癌（NSCLC）患者术后标本中检测到由染色体2p的倒位，造成棘皮动物微管相关类蛋白4（EML4）第13外显子的N-端与ALK（间变性淋巴瘤激酶）第20外显子的激酶区融合，经检测，此种融合基因的表达产物为嵌合酪氨酸激酶，可在细胞内自发形成多聚体后，持续的促进细胞增殖，导致肿瘤的产生和转移。而利用ALK激酶的抑制剂限制其活性，能够有效的阻止癌细胞的继续分裂，并促进癌细胞的凋亡。临床实验结果也显示，对ALK融合阳性患者使用ALK抑制剂（如Crizotinib）治疗能延长病人的生存期。 

除了EML4基因第13外显子与ALK基因第20外显子融合（简写：E13;A20）亚型外，在肺癌患者中还报道了另外20多种融合的变异类型。分析这些融合基因的结构发现，其ALK基因部分都开始于编码细胞内酪氨酸激酶结构域的20外显子，而EML4部分则包括长短不一的编码蛋白N端部分的基因片段经检测，所有EML4-ALK融合基因均有生物学功能。 

一般非小细胞肺癌人群中EML4-ALK阳性率较低，约为3%～7%左右。目前，中国初步的ALK流行病学研究显示，融合基因检测的发生率为11.6%，在腺癌的发生率为16.13%(10/62)，在非吸烟者为19.23%(10/52),在不伴有EGFR或KRAS突变的腺癌中高达42.80%。 

目前已有检测EML4-ALK基因融合的产品上市，如Abbott公司的Vysis ALK Break ApartFISH Probe Kit系列产品，它是基于荧光原位杂交技术（FISH）分析染色体的断裂情况，但其只能检出融合基因是否存在，不能准确得出具体的融合类型，且灵敏性较低；传统的RT-PCR然后测序法、半定量PCR技术，则存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性均不能满足实际应用的需要。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测EML4-ALK融合基因的PCR引物，所述PCR引物可用于单独或并行检测EML4-ALK融合基因的21种基因融合亚型：E13;A20、E13;ins69;A20、E20;A20、E20;ins18;A20、E6;A20、E6;ins33;A20、E6;ins18;A20、E2;A20、E2;ins117;A20、E15;A20、E17;ins29;A20、E17;ins94;A20、E17;A20、E17;ins68;A20、E18;A20、E21;A20、E14;ins11;del49A20、E14;del14A20、E14;ins64;del69A20、E13;A21、E2;A21。 

实现上述目的的技术方案如下： 

一种检测EML4-ALK融合基因的PCR引物，包括有针对融合类型E13;A20、E13;ins69;A20、E14;ins11;del49A20、E14;del14A20、E14;ins64;del69A20的SEQ ID NO.1和SEQID NO.3、针对融合类型E20;A20、E20;ins18;A20、E21;A20的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4、针对融合类型E6;A20、E6;ins33;A20、E6;ins18;A20的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5、针对融合类型E2;A20、E2;ins117;A20的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6、针对融合类型E15;A20的SEQID NO.1和SEQ ID NO.7、针对融合类型的E17;ins29;A20、E17;ins94;A20、E17;A20、E17;ins68;A20、E18;A20的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8、针对融合类型E13;A21的SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3、和/或针对融合类型E2;A21的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6。