[发明专利]一种蛋白酶生产工艺

说明书

技术领域

本发明属于酶生产技术领域，具体涉及一种利用地衣芽孢杆菌来生产蛋白酶的工艺。

背景技术

目前，国内常采用技术水平较落后的固体发酵法来生产蛋白酶，其存在劳动强度大，生产环境条件差，染菌率高等弊端，产品多为固体粗制酶，仅能用于皮革、丝绸脱胶等少数行业，不能适应食品、饲料、洗涤剂等行业发展的需要。因而，食品、饲料、洗涤剂等对蛋白酶质量要求较高的行业普遍使用的是进口产品，其价格昂贵，增加了企业的生产成本。

发明内容

本发明目的在于提供一种蛋白酶生产工艺，该工艺原料利用率高，蛋白酶品质好。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的。

一种蛋白酶生产工艺，其包括以下步骤：

1）种子培养：将地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）接入斜面培养基在好氧条件下于30—37℃培养24—30h，然后将培养好的斜面菌种接入种子培养基中，于30—37℃恒温摇床培养32—37h；再把培养好的菌种接入一级种子培养基于31—38℃培养9.5—13h；

2）发酵：将培养好的一级种子接入发酵培养基于32—38℃培养31—35h；

3）提取蛋白酶：将培养好的发酵液转入回收罐并向其中加入硅藻土和珍珠岩，搅拌均匀，经固液分离、超滤膜超滤处理及喷雾干燥后即得。

具体的，所述步骤1）中，斜面培养基组成为：蛋白胨 0.3—0.5%，牛肉膏 0.2—0.3%，磷酸二氢钾0.2—0.5%，琼脂1.5—1.7%，pH自然。种子培养基组成为：蛋白胨 0.3—0.5%，牛肉膏 0.2—0.3%，磷酸二氢钾0.2—0.5%，pH自然；一级种子培养基组成：豆粕3—5%，薯干粉2.4—3.2%，麸皮3.6—3.9%，磷酸氢二钠0.4—0.6%，磷酸二氢钾0.03—0.07%，菜籽油0.4—0.8%，pH自然。

所述步骤2）中，发酵培养基组成：豆粕3—5%，薯干粉2.7—3.5%，麸皮3.8—4.3%，磷酸氢二钠0.4—0.6%，磷酸二氢钾0.03—0.07%，菜籽油0.4—0.8%，pH自然。

所述步骤3）中，硅藻土、珍珠岩的添加量均为发酵液重量的2—6%；所用超滤膜的截留分子量为10000。

所述的蛋白酶生产工艺，具体步骤如下：

一、种子培养：

将地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）接入斜面培养基在30—37℃恒温培养箱中培养24—30h，然后将培养好的斜面菌种接入（接种量2—5%）装有种子培养基的摇瓶中，于30—37℃恒温摇床（转速140—150r/min）培养32—37h。

将一级种子培养基投入种子罐进行灭菌（121~123℃ 实消40~45分钟），然后通风降温到31—38℃，将摇瓶培养好的菌种以1—5%的接种量接入一级种子培养基，保证罐压在0.05—0.08Mpa，风量在12—26m3/hr（发酵罐内的空气需进行杀菌过滤处理）；温度控制在31—38℃，210—270 r /min培养9.5—13h，镜检，确保成熟无杂菌转入发酵罐。

二、发酵：

将发酵培养基装入发酵罐进行灭菌（121~123℃实消40~45分钟），然后通风降温到32—38℃。以5—8%的接种量，接入培养好的一级种子进行发酵，发酵时间31—35小时。

其中，在发酵过程中不同时间点的发酵温度如下所述时，效果较好：0—2h于32—38℃培养；2—10h时，每小时升1℃，即到第10h温度升至40—46℃；10—20h时，每小时降1℃，即到第20h温度降至30—36℃。保证罐压0.05—0.08Mpa；风量0~7小时190—210m³/h，发酵液与风量比（m³：m³/min，下同）为1：0.45—0.51；8~15小时风量250—280m³/h，发酵液与风量比为1：0.59—1.63。第16小时左右泡沫开始升高，此时调节风量，16h至发酵结束，发酵液与风量比为1：0.67—0.71，风量280—300m³/小时。发酵结束时，酶活力最低约达到32000U/ml。

发酵过程中，自第10—12小时开始，每4小时取样测酶活力、PH、镜检菌形；第23—26小时开始，每2小时一次取样测酶活力、PH、镜检菌形。连续两次检测酶活力不上升，镜检菌形50—60%芽孢以上，温度上升缓慢或无上升趋势，即可结束发酵。

三、提取蛋白酶