[发明专利]检测贝氏柯克斯体的专用引物无效

专利信息
申请号: 201210443081.3 申请日: 2012-11-08
公开(公告)号: CN102925574A 公开(公告)日: 2013-02-13
发明(设计)人: 王锡乐;温博海;熊小路;齐永;段长松;李佳明;焦俊;贾引军;龚文平 申请(专利权)人: 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/01
代理公司: 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人: 关畅
地址: 100071 北京市丰*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 检测 贝氏柯克斯体 专用 引物
【说明书】:

技术领域

发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种检测贝氏柯克斯体的专用引物。

背景技术

贝氏柯克斯体是1935年首次从澳大利亚病人中分离到的立克次体样病原体,属专性胞内寄生、革兰氏阴性嗜酸菌。贝氏柯克斯体所致疾病称为Q热(Q fever)。Q热分为急性和慢性两种临床类型。急性Q热表现为急性流感样症状,以头痛、发热、肺炎为主要特征,而慢性Q热主要表现为长期发热,常伴有心内膜炎、肝炎、骨髓炎等。贝氏柯克斯体的感染剂量极低,单个病原体即可致病,因此该病原体已被某些国家用作生物武器、还可能被恐怖组织用作生物恐怖剂。目前已经报道的Q热病例遍及全球各大洲几乎所有国家,成为当前分布最广的人兽共患病之一。传统的普通PCR和实时荧光定量PCR方法等常需要花费较长时间或者需要特定的仪器,难以满足暴发疫情快速诊断的需要。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)具有在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶序列的特点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测贝氏柯克斯体的环介导等温扩增引物组。

本发明提供的检测贝氏柯克斯体的环介导等温扩增引物组,由引物1、引物2、引物3和引物4组成;

所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

上述引物组中,引物1、引物2、引物3和引物4的摩尔比为1:1:8:8。

本发明的另一个目的是提供一种检测贝氏柯克斯体的环介导等温扩增试剂。

本发明提供的检测贝氏柯克斯体的环介导等温扩增试剂,包括上述的引物组和环介导等温扩增缓冲液。

上述环介导等温扩增试剂由上述的引物组、环介导等温扩增缓冲液和水组成;

所述引物1和所述引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5pmol/L,

所述引物3和所述引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为40pmol/L。

本发明的第三个目的是提供一种检测贝氏柯克斯体的环介导等温扩增试剂盒。

本发明提供的试剂盒,包括上述的引物组或上述的环介导等温扩增试剂。

上述的引物组、上述的环介导等温扩增试剂、上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测贝氏柯克斯体产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中,所述检测为环介导等温扩增反应,所述环介导等温扩增反应的条件为:60-65℃反应30-90min,具体为63℃反应90min;再80℃5min终止反应。

上述检测和/或辅助检测贝氏柯克斯体为用上述环介导等温扩增试剂对待测样本(贝氏柯克斯体)进行环介导恒温扩增反应,检测环介导恒温扩增反应产物;

上述检测环介导恒温扩增反应产物可通过如下方法判断:

1)通过反应液的浊度进行分析判定:核酸大量合成时,dNTP会析出大量的焦磷酸根离子,焦磷酸根离子与LAMP体系中的Mg2+(或Mn2+)结合,产生焦磷酸镁或焦磷酸锰沉淀,从而引起反应液的浊度变化;基于该原理,可以根据反应液的浊度变化判断是否有核酸大量合成,从而判断模板是否为靶序列;若浑浊,则为阳性,反之为阴性;

2)采用实时浊度仪及其配套程序软件实时检测反应液,若实时浊度仪上观察到典型的扩增曲线,则表明待测样本来自贝氏柯克斯体,为阳性,反之为阴性。

本发明的实验证明,本发明发现了4条专用引物,采用环介导等温扩增法可对贝氏柯克斯体进行特异性检测和定量分析,本发明的引物和方法具有如下优点:(1)只需在恒定温度就能扩增反应,不需要特殊设备;(2)特异性高;(3)快速高效,扩增反应在60分钟内即可完成;(4)灵敏度高;(5)鉴定方便简单。本发明的引物适用于临床标本的快速检测。

附图说明

图1为实施例2的灵敏度检测的实时浊度仪扩增结果和扩增曲线。

图2为实施例2的特异性检测的实时浊度仪扩增结果。

图3为实施例2的重复性检测的实时浊度仪扩增结果(A)以及扩增曲线(B)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。

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