[发明专利]一种通过幼苗诱导的愈伤对玉米进行基因转化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过幼苗诱导的愈伤对玉米进行基因转化的方法。

背景技术

转基因植物是指采用基因工程手段将从不同生物中分离或人工合成的外源基因在体外进行酶切和连接，构成重组DNA分子，通过微生物介导、人工原生质体、显微注射以及基因枪轰击等方法，直接导入到植物体细胞内或组织中，使新的基因在植物细胞或组织内整合、表达，并能通过无性或有性增值过程，将外源基因遗传给后代，由此获得基因改良植物，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。这一技术克服了植物有性杂交的限制，使基因交流的范围无限扩大，可将从细菌、病毒、动物、远缘植物、人类甚至人工合成的基因导入植物，所以其应用前景十分广阔(Twyman，2003；Walmsley，2000)。转基因植物技术及其产品是当今世界农业生物技术研究与产业化开发的重点和热点，是我国农业科技革命的核心内容之一，对我国农业科技手段的更新换代以及农业产业结构的调整具有重要的战略意义。随着现代生物技术的迅速发展，植物转基因技术方兴未艾，因而对它的研究意义也显得尤为重要。

1986年Fromm等(1986)利用电击法首次将抗除草剂pat基因转入玉米原生质体中，获得了稳定整合和表达的愈伤组织，实现了玉米遗传转化的重大突破，但是没有获得转化植株。1988年Rhodes等(1988)首次获得玉米转基因完整植株，随后Prioli等(1989)、Shillito等(1989)、Fromm等(1990)分别于1989年和1990年报道获得了可育的玉米转化植株。

到目前为止，世界转基因玉米研究已经从转化方法的探索发展到商品化阶段。在短短20年的时间里，玉米转化受体、转化方法以及目的基因应用等各方面的研究都取得了迅速发展。

玉米遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株可分成两大类，第一类需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，目前比较成熟的主要有花粉管通道法。

农杆菌介导的遗传转化过程主要包括5个步骤(顾红雅，1997)：(1)细菌在植物敏感细胞上吸附；(2)农杆菌中Ti质粒的vir区被激活；(3)T-DNA的切割和T-DNA复合物的形成；(4)T-DNA复合物由农杆菌进入植物细胞；(5)T-DNA整合到染色体上并进行表达。

选择和建立良好的植物受体系统是基因转化能否成功的关键因素之一。所谓植物基因转化受体系统，是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其它非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。目前用于玉米基因转化的受体系统主要有以下几种：

(1)胚性愈伤组织

1949年LaRue(1949)用甜玉米的胚乳作外植体首次诱导出愈伤组织，但最终未获得再生植株。直到Green等(1975)用A188的幼胚作外植体，诱导出二倍体愈伤组织，并获得再生植株，从此，玉米组织培养技术不断完善。愈伤组织由外植体诱导形成，有两种类型，大多数玉米自交系易形成致密的I型愈伤组织，这种愈伤组织胚性差，继代后较难再生出植株；另一种松脆的II型愈伤组织生长迅速，可以长期继代保持胚性，便于产生胚性悬浮细胞系，继而制备原生质体，虽然玉米II型愈伤组织的诱导受到基因型的影响，但其仍是目前玉米转化的常用受体，具有较高的转化频率和再生频率。愈伤组织多是以幼胚作外植体诱导产生而来，比较容易获得，再生能力较强，获得转化植株的周期相对较短，仍然是目前应用最广泛的受体材料。Huang等(2004)利用成熟胚建立高效的再生体系时也在成熟胚中获得了较高的胚性愈伤组织发生率，因此对便于操作的成熟胚进行研究，诱导胚性愈伤组织可能有会建立理想的转化受体系统。

由于胚性愈伤组织再生能力较强，容易大量繁殖，获得转化植株的周期较短，是目前应用最广泛的受体材料之一。但是，从外植体诱导的愈伤组织常是由多细胞形成，本身就是嵌合体，因而分化的不定芽嵌合体比例更高，这就使筛选转基因再生植株的难度加大。再者，愈伤组织所形成的再生植株无性系变异较大，转化的外源基因遗传稳定性较差，为了克服这种困难，有人提出几种方法，如借助非转化正常植株的花粉授粉、延长生长过程、使其尽量减少变异等。

(2)幼胚