[发明专利]一种海参体表细菌DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种海参体表细菌DNA提取方法。

背景技术

近些年随着我国水产养殖、加工业的飞速发展，仿刺参养殖与加工数量逐年递增。开展仿刺参体表、肠道菌群多样性分析，可以为海参的微生态学研究提供极好的原始资料和数据、为更好的了解海参携带的生物信息、为我国海参养殖和加工业的健康发展提供良好帮助。

细菌总DNA提取方法较多，主要有CTAB、试剂盒、苯酚氯仿抽提等方法，在实际操作中切实可行。仿刺参表皮含有大量的粘液物质，其富含蛋白质和粘多糖，按照通用细菌总DNA提取方法，根本无法正常提取到海参体表细菌总DNA，提取的细菌DNA电泳图拖尾严重。根据多年的实验摸索和反复操作，在CTAB方法基础上，增加了样品前处理以降低样品的粘度，以及采用增加蛋白酶量和CTAB溶液去除杂蛋白和粘多糖物质，可获得理想的海参体表细菌DNA。

微生物在自然界分布广泛，细菌DNA的提取极易受其所处环境的影响。通常处于空气、水体、土壤中的细菌可采用常规的细菌DNA提取方法。而附生、寄生的细菌通常处于植物或动物的体表或体内，生存环境富含多糖和蛋白质等营养物质，采用常规方法很难将它们与宿主分离，因此常规方法无法获得此类细菌DNA，这个问题一直困扰着此领域的研究者。

发明内容

为解决上述技术问题所采用的技术方案是：在对海参体表细菌DNA提取过程中，本发明主要目的是去除杂蛋白、粘多糖对样品的干扰，降低样品粘度以利于体表细菌的溶出。首先对样品进行超低温冷冻以降低样品粘度，利于样品中的细菌分散到具有缓冲、降低粘度的洗脱液Ⅰ中；在菌体收集步骤中，通过多次低速离心除去样品中糊状的多糖和蛋白；增加了粘多糖和杂蛋白的脱除步骤，裂解液中添加了CTAB溶液以去除粘多糖，添加蛋白酶K进一步去除可溶性杂蛋白的干扰；最终通过洗脱液Ⅱ抽提，获得细菌DNA。

本发明所述的一种海参体表细菌DNA的提取方法，其包括以下步骤，

（1）海参样品处理：

取鲜活海参用无菌生理盐水冲洗三次，无菌封装后，迅速放置-80℃保存24h，取出海参在无菌条件下，用无菌刀片刨刮海参体表，将刨刮物放于无菌离心管中，50mL离心管装6~10g(湿重)海参体表刨刮物；

（2）海参体表菌体收集：

①向步骤（1）获得的离心管中，加入15~20mL洗脱液Ⅰ，常温下300rpm震荡5~10min，使刨刮下的海参体表粘稠物与洗脱液Ⅰ充分混合；

②4℃下1000rpm离心5~8min，去除下层海参组织沉淀物及上层糊状物，将剩余液体转移到另一无菌离心管中；

③重复步骤②直至完全去除沉淀物和糊状物；

④将步骤③所得液体分装于1.5mL离心管，并于4℃10000rpm离心1~2min，收集沉淀，即为海参体表菌体沉淀物；

（3）粘多糖和杂蛋白的脱除：

于步骤④所得海参体表菌体沉淀物中，加入500uL裂解液，吹打至沉淀悬浮，然后55℃孵育震荡1~3h，直到悬浮液澄清，简短离心以去除管盖内壁水珠。

（4）细菌破壁

上述液体中加入180uL溶菌酶（20mg/mL），于37℃孵育酶解30min以上，期间间隔震荡直到产生的白色沉淀消失，简短离心以去除管盖内壁水珠。

（5）抽提、纯化：

⑤向步骤（4）获得的酶解液中加入300uL苯酚和300uL洗脱液Ⅱ，充分混匀后4℃12000rpm离心10~15min；

⑥吸取步骤⑤中上清液500uL，加入洗脱液Ⅱ500uL于1.5mLEppendorf试管中，混匀后4℃12000rpm离心10min；

⑦吸取步骤⑥中上清液400uL，加入无水乙醇（事先于-20℃预冷）800uL于1.5mLEppendorf试管中，混匀后-20℃静置20min，4℃下12000rpm离心10min；

⑧白色沉淀用70%的乙醇洗涤2~3次，晾干后溶于100uL无菌超纯水中，轻轻震荡直至沉淀溶解，或放置于50uL缓冲液TE中，于-20℃条件下贮存。

其中，本发明上述技术方案中使用的部分试剂的配制方法如下：

洗脱液Ⅰ：磷酸二氢钾：0.27g，磷酸氢二钠：1.42g，氯化钠：8g，氯化钾：0.2g，加去离子水约700mL充分搅拌溶解，用盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。然后加入200mL的CTAB溶液，高温高压灭菌后室温保存。

裂解液：3mL的CTAB溶液中，加入6uL的β-巯基乙醇和30uL蛋白酶K（50mg/mL）。