[发明专利]一种新型防御素BD2及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新型防御素BD2及其基因和应用。

背景技术

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是天然免疫系统的重要成员，在防御外界病原菌侵染时具有重要作用，具有反应时间快、耐药性、广谱抗菌活性等优点。β-防御素（defensin）属于一类含有30-45个氨基酸残基的抗菌肽，β-防御素主要分布于呼吸道、胃肠道、生殖道表面和腺体中的一种富含半胱氨酸的阳离子小分子抗菌肽，形成抵抗病原体的第一道重要防线。最早的β-防御素是在牛的气管黏膜上皮细胞中发现的牛气管抗菌肽(TAP)(Diamond G et al.,Proc Natl Acad Sci USA,88(9):3952-3956,1991)。

防御素是一类分子量为3-4KDa的非糖基两亲（亲水、亲脂）低分子短肽，一般富含精氨酸，带正电荷。分子中有6个半胱氨酸残基，形成3对二硫键，含有3个相应对称的β折叠片结构，缺少α螺旋结构域（Schneider JJ,et al.Journal of MolecularMedicine 83:587-95,2005;Dhople V，et al.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes 1758:1499-512,2006）。借助于细胞这个媒介，无论在细胞内或细胞外，防御素都可以直接杀死细菌、真菌、病毒等病原微生物。在细胞内环境中，它们通过吞噬微生物而促成厌氧菌的死亡。当被释放到细胞外环境中，它们通过攻击微生物外膜发挥抗菌活性。除此之外，防御素还作为机体内外免疫系统的“仲裁者”进行免疫调节以及创伤和神经损伤的修复。防御素在宿主的嗜中性粒细胞、粘膜表面、皮肤和其他上皮细胞免疫中起重要作用，其定位和调控是通过抵抗病原的侵袭和内生细菌的生长两种途径来实现（De Yang,et al.Trends in Immunology 23:291-296,2002;Zasloff.Nature 415:389-395,2002;Lai Y，et al.Trends in Immunology 30:131-41,2009）。

现在越来越多的病原菌对抗生素产生耐药性，抗菌肽作为抗生素的替代品成为不可阻挡的趋势。β-防御素作为抗菌肽的重要成员，具有广谱抗细菌和抗病毒活性，对于防御外界病原微生物的侵害具有重要作用。目前对人类β-防御素的研究较多，β-防御素在鱼类中的研究，尤其是功能方面的报道还比较少。且都集中于海水鱼类的研究（郭洪燕等，生命科学,24(4):321-327,2012）。近些年来，随着养殖环境的恶化、养殖密度的增大，鱼类病害不断发生，造成了巨大的经济损失，β-防御素在水产养殖业上的应用也是后续要解决的问题。泥鳅作为一种鲤形目的淡水鱼是一种新型且具有代表性的研究对象，为开发具有广谱抗菌活性的防御素且投入于水产饲料、渔药等行业的应用提供了基础。β-防御素虽然具有广谱抗菌活性，但是其表达量还是较低的，要想得到大范围的应用，通过基因工程的方法得到具有生物学活性的β-防御素也是目前需要解决的一大问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种防御素BD2。

本发明的再一目的是提供编码上述防御素的基因bd2。

本发明的再一目的是提供包含上述防御素基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述防御素基因的重组质粒。

本发明的再一目的是提供一种制备防御素的方法。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的新防御素。本发明的发明人从泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）中得到一个新的具有抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌活性的防御素。适合于水产饲料、渔药等行业中使用。

从泥鳅中获得了一种防御素BD2，该蛋白含有62个氨基酸和一个终止密码子，前端19个氨基酸为的信号肽序列。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

1 MRVLRLLVIT LLLLTAGEAY DTEIQGWTCG SRGLCRKHCY AQEHTVGYHG

51CPRRYRCCAL RF*

本发明还提供了编码上述防御素的基因组DNA序列和cDNA序列。基因组DNA序列如SEQ ID NO.2所示，全长1002bp，包括三个外显子及两个内含子。其中52-164bp为第一个内含子，282-981bp为第二个内含子。cDNA序列全长189bp，如SEQ ID NO.3所示。