[发明专利]一种检测磺胺嘧啶的酶联免疫试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种磺胺嘧啶酶联免疫检测试剂盒，属于生物及食品安全检测技术领域。。 

技术背景

磺胺嘧啶，作为磺胺类药物的一种，其性质稳定、抑菌谱广、毒性小、口服易吸收且价格低廉，是畜牧业上应用最广泛、应用量最大的药物之一。但是由于它在体内的作用时间和代谢时间较长，易残留在动物体内，通过任何途径都可能在人体中蓄积。药物蓄积浓度超过一定值对人体机能是有害的，长期蓄积则会导致磺胺药抗药性的产生，造成耐药菌的流行性感染，且有潜在的致癌性。因此，欧盟对牛奶和肉类食品中的磺胺类药物制定了最高允许值，即磺胺类药物总量不得超过 100 μg/ kg，单个磺胺类药物的浓度不得超过 25 μg/kg。2002 年 12 月我国农业部公告第 235 号文件规定在所有食品动物的肌肉、脂肪、肝和肾中磺胺类最高残留限量 100 μg / kg，并将磺胺嘧啶列作为重点监控的对象。 

目前，检测磺胺嘧啶的方法有微生物法，物理化学法，如高压液相色谱 (HPLC) 、气-液色谱 (GLC) 、质谱 (MS) 、薄层色谱法 (TLC) 等，微生物法检测速度较快，但对磺胺药缺乏灵敏性和特异性，物理化学法则存在前处理繁琐，需要昂贵仪器及其专业操作等特点，检测大批样本较为困难，不利于大范围的推广应用。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便、快速、适合大批量样品初筛的磺胺嘧啶酶联免疫检测试剂盒。 

本发明解决上述技术问题采取的技术方案： 

本发明所提供的检测磺胺嘧啶的酶联免疫试剂盒，包括磺胺嘧啶特异性抗体及包被的磺胺嘧啶与载体蛋白偶联物和酶标二抗，或包被的二抗和酶标磺胺嘧啶。其中，所述磺胺嘧啶特异性抗体可为磺胺嘧啶单克隆抗体或磺胺嘧啶多克隆抗体，所述磺胺嘧啶单克隆抗体优选为磺胺嘧啶鼠单克隆抗体，所述磺胺嘧啶多克隆抗体优选为磺胺嘧啶兔多克隆抗体，以上抗体均可按常规方法制备；所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA) 、卵清蛋白(OVA)、血兰蛋白(KLH)等常用载体蛋白，所述磺胺嘧啶与载体蛋白的偶联物可通过将磺胺嘧啶和载体蛋白用戊二醛法或重氮化法进行偶联得到；所述标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸醋酶，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在抗体或磺胺嘧啶上所述二抗优选为抗鼠或抗兔抗抗体。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括磺胺嘧啶标准溶液、显色剂、浓缩洗涤液、终止液、浓缩复溶液。 

所述浓缩洗涤液为含有0. 8%-1. 2%吐温的磷酸盐缓冲液；所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化氢脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述浓缩复溶液为含有0. 1 %-0. 5 %DMF的磷酸盐缓冲液。 

本发明的检测原理为将磺胺嘧啶与载体蛋白的偶联物作为包被原吸附于固相载体上或将抗兔或抗鼠的抗抗体吸附于固相载体上，加入样品和磺胺嘧啶特异性抗体，当酶标板为磺胺嘧啶与载体蛋白偶联物包被的固相载体时，加入酶标二抗，当酶标板为抗兔或抗鼠的抗抗体包被的固相载体时，加入酶标磺胺嘧啶，待测样品中残留的磺胺嘧啶和固相载体上包被的磺胺嘧啶与载体蛋白偶联物或酶标磺胺嘧啶竞争特异性抗体，显色后终止，测定样品吸光值，该值与样品中磺胺嘧啶残留物含量呈负相关，与标准曲线（图1）比较即可得出磺胺嘧啶的含量。 

本发明的检测磺胺嘧啶的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA 方法定性或定量检测动物组织、血清、尿样、蜂蜜、牛奶及饲料等样品中磺胺嘧啶的残留量;对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品;采用高特异性的磺胺嘧啶单克隆抗体或多克隆抗体，主要试剂均以工作液形式提供，检验方法方便易行；高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，将在食品和饲料磺胺嘧啶残留量的检测中发挥重要作用。 

抗原的合成： 

将磺胺嘧啶和人血清白蛋白(HSA)采用戊二醛法进行偶联得到免疫原。将磺胺嘧啶和卵清蛋白(OVA)采用戊二醛法进行偶联得到包被原。

磺胺嘧啶鼠单克隆抗体制备： 

动物免疫程序采用BALB/c小鼠作为免疫动物，以磺胺嘧啶与人血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为80-100 μg/只，首免时将抗原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。