[发明专利]丹波黑大豆C2H2型锌指蛋白基因STOP1的植物表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种丹波黑大豆根中铝诱导的C2H2型锌指蛋白基因STOP1的植物表达载体pPZP-35S-STOP1及其提高植物抗铝毒胁迫能力的应用。

背景技术

铝毒是酸性土壤中植物生长和作物产量的主要限制因素。酸性土壤占世界可耕种土壤的30%，主要分布在南非、中亚和东南亚对粮食需求量最大的发展中国家。我国的酸性土壤主要分布在长江以南的热带、亚热带及云贵川等地区，面积达204万公顷，大部分土壤的pH值小于5.5，其中很大一部分小于5.0。农业上通常依靠施加生石灰以缓解酸性土壤中的铝毒问题，然而这种方法只能改良表层土壤，并不能改变深层土壤的pH值，且耗费大量的经济和人力。因此，在降低土壤酸度的同时，挖掘植物自身的抗铝潜力，利用基因工程手段在植物中过量表达抗铝基因，是解决酸性土壤中铝毒害和农业生产可持续发展的有效策略。

铝诱导的植物根尖苹果酸的分泌是植物抗铝的主要机制，苹果酸的分泌由苹果酸通道蛋白基因（ALMT1）所控制。目前已从多种耐铝植物中克隆得到了ALMT1。ALMT1是一类含有UPF0005结构域且具有5-7个跨膜结构域的跨膜蛋白。TaALMT1是从耐铝小麦（Triticum aestivum）ET8中克隆得到的第一个植物耐铝基因，生理及电生理实验发现，铝耐受性小麦品种在铝胁迫下有机酸的分泌是通过开启有机酸阴离子通道来实现。很多研究结果表明，过量表达有机酸通道蛋白基因是提高植物抗铝能力的有效手段。如抗铝小麦ET8主要的抗铝基因TaALMT1在水稻和烟草细胞中异源表达后引起铝诱导的苹果酸外流，因而提高烟草细胞的耐铝能力。将TaALMT1基因转入大麦中过量表达，转基因大麦具有与ET8相似的苹果酸分泌和抗铝能力。如Delhaize等发现表达TaALMT1的转基因大麦具有一个铝激活的苹果酸流，当转基因大麦受到铝胁迫时可以增加苹果酸和对铝毒的抗性。进一步的研究发现转基因大麦在酸性土壤上可以更有效的吸收磷元素，产量也比非转基因株系高。Pereira等在小麦种过表达TaALMT1基因，结果9个T2代转基因株系的TaALMT1表达增强，苹果酸的分泌量和铝耐受性显著提高。一些T2代转基因株系在含有铝溶液和土壤中培养时铝耐受性都高于抗铝小麦品种ET8。抗铝油菜品种中铝诱导根的苹果酸分泌与BnALMT1和BnALMT2的高表达有关。过量表达BnALMT1和BnALMT2的转基因烟草细胞在铝胁迫下苹果酸分泌比野生型细胞高8-11倍，鲜重增加3-4倍。AtALMT1是拟南芥的重要抗铝基因之一，该基因的突变使其对铝敏感性增加。Ryan等的研究证实过表达AtALMT1的转基因拟南芥RRG比野生型高大约3倍。

在拟南芥中，C2H2锌指蛋白转录因子STOP1直接或间接的通过一个信号通路控制了有机酸通道蛋白基因AtALMT1和AtMATE的表达，STOP1的正常表达使拟南芥具有对低pH和铝的抗性。在STOP1-KO的拟南芥突变体中，铝诱导的苹果酸和柠檬酸的分泌受到抑制。在STOP1（STOP1-MT）诱变突变体中，与拟南芥抗铝有关的基因如AtALMT1、AtMATE和ALS3（铝敏感3）的表达水平也均被抑制，且与耐酸有关基因的表达也被下调。可见，STOP1通过调节耐酸和抗铝基因的表达而赋予拟南芥对酸和铝的抗性。随后Yamaji等在水稻也发现了与STOP1类似的一个锌指蛋白ART1（铝抗性转录因子1）。然而，与STOP1不同的是，ART1的表达不受铝调节且呈组成型表达的。研究发现，ART1在水稻种调节铝诱导的30多个基因的表达，其中包括已鉴定的水稻抗铝基因，如Mg²⁺通道单边基因，STAR1和STAR2（ABC转运蛋白），MATE（柠檬酸通道蛋白）等。此外，ART1还调节了水稻中的一个Al³⁺转运蛋白基因Nrat1(Nramp Al³⁺通道蛋白)的表达。可见，该基因在水稻抗铝性中有很关键的作用。