[发明专利]长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种简便实用的长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法。

背景技术

我国长爪沙鼠的实验动物化研究始于1978年，目前我国主要有两个长爪沙鼠群，分别保存于浙江省实验动物中心和首都医科大学。长爪沙鼠对食物中的脂肪、维他命E、胆固醇敏感，可作为研究食物源性胆固醇诱导的高胆固醇血症的动物模型。长爪沙鼠肝脏中低密度脂蛋白受体的表达与食物源蛋白显著相关，而人肝癌细胞的低密度脂蛋白受体表达则无显著变化，表明在研究细胞表面受体时原代肝细胞较瘤化的肝细胞系具有优势。值得注意的是长爪沙鼠的脂代谢与人类的脂代谢有诸多相似。长爪沙鼠血液中载脂蛋白与高密度脂蛋白胆固醇水平呈高度正相关，与人类代谢研究结果一致；低密度脂蛋白是脂蛋白胆固醇的主要载体，与人类相近；对红花油、橄榄油或椰子油的反应都与人相似。此外，长爪沙鼠是杂食性动物，由贫瘠的荒漠地带至实验室环境，饮食结构中脂质含量显著增加，与国民饮食结构改善类似。且长爪沙鼠个体小、易管理，因而是研究脂代谢的良好动物模型。

肝脏在脂质代谢中起着重要作用，它能合成脂蛋白，有利于脂质运输，也是脂肪酸氧化和酮体形成的主要场所。肝脏主导胆固醇代谢，胆固醇在肝脏中合成，并可转变成胆汁酸盐随胆汁排出，同时肝脏还能将碳水化合物转变成脂肪。肝细胞是肝脏众多功能的最终承担者，肝细胞的体外培养成为很多体外实验研究的前提，治疗药物的研发、细胞周期的调控、激素与受体的相互作用等都广泛地应用离体肝细胞模型。原代肝细胞较好保留并维持了肝细胞形态的完整性和体外代谢活性，可以在接近生理浓度的情况下开展研究，并排除了其他器官、组织的影响。原代肝细胞培养已广泛应用于药物的体外代谢研究，它能在较短时间内得到大量的代谢产物，相对而言易于控制代谢条件、代谢体系单纯，在研究药物代谢途径、代谢机制和药物相互作用，尤其在代谢物结构鉴定方面具有较大的优越性。

中国专利申请CN200910031021.9中公开了一种大鼠肝细胞分离培养的方法。大鼠用戊巴比妥钠麻醉，并给予肝素钠抗凝，做门静脉插管，两步灌流法灌流，取下消化成熟肝脏，收集肝细胞于4℃含1%牛血清白蛋白（BSA）的HANKS液中，肝细胞悬液用筛网过滤，滤液离心、沉淀后，收集沉淀于LEIBOVITZ’S-15（L-15）完全培养基中，调整肝细胞密度为3～6×10⁵个/mL接种于铺鼠尾胶原的培养板中，于37℃、5%CO₂环境中培养。接种后4h换液去除未贴壁及死细胞，继续培养20h后可用于试验。但该方法并不适用于长爪沙鼠肝细胞的培养。

理想的肝细胞是该体外模型建立的前提，高产量、高活性、功能良好的肝细胞是其关键因素。目前国内尚无关于长爪沙鼠原代肝细胞离体模型的研究，国外也尚未建立完善的培养体系。

发明内容

本发明旨在针对目前长爪沙鼠肝细胞培养方法的空缺，提供了一种简便实用的长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，为长爪沙鼠肝细胞应用于科学研究提供技术保障。

一种长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，包括步骤：

（1）从消化成熟的离体长爪沙鼠肝脏中收集肝细胞初悬液，过滤，滤液除杂后加入含5%小牛血清的Hank′s平衡盐溶液（Hanks Balanced SaltSolutions，简称HBSS），反复离心洗涤，收集细胞沉淀于含20%新生牛血清的DMEM完全培养基中，调整肝细胞浓度为3.0×10⁵个～5.0×10⁵个/mL，制备成肝细胞悬液；

（2）将肝细胞悬液接种于铺有鼠尾胶原的培养板中，于37℃、5%CO₂环境中培养，4h后除去死亡及悬浮细胞，将培养基更换成含细胞因子的维持培养基，细胞贴壁过夜后，得到长爪沙鼠原代肝细胞。

步骤（2）中，所述的含细胞因子的维持培养基为：在DMEM基础培养基中加入10%新生牛血清、5μg/mL胰岛素、4μg/mL地塞米松、10ng/mL表皮细胞生长因子、5ng/mL肝细胞生长因子和2%二甲基亚砜（DMSO）；pH=7.0-7.4。含细胞因子的维持培养基的配制方法包括：在DMEM基础培养基中加入新生牛血清、胰岛素、地塞米松、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子和DMSO，混合均匀，调节pH=7.0-7.4，制得含细胞因子的维持培养基，其中，新生牛血清的浓度为10%，胰岛素的浓度为5μg/mL，地塞米松的浓度为4μg/mL，表皮细胞生长因子的浓度为10ng/mL，肝细胞生长因子的浓度为5ng/mL，DMSO的浓度为2%。