[发明专利]一种基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于亚甲基蓝DNA指示剂技术定量检测 PCR 扩增产物的电化学安培电流测定方法。

背景技术

随着分子生物学和生物技术的发展，特别是人类基因组计划的实施，让人们更深刻的认识到作为遗传信息的携带者，DNA 的结构变化会对生物体产生重大的影响，并且与多种遗传疾病的起因有关。因此，人们对 DNA 的检测手段变得越来越重要。在基因分析技术中，聚合酶链反应 (PCR) 技术以其简便、快速、灵敏的优势，成为基因诊断和分析的重要手段。但是 PCR 技术存在着急需解决的二大问题：一是不能定量，二是污染所致的假阳性。90年代初期，随着分子生物学技术研究的不断进展，定量 PCR 技术取得了突飞猛进的发展，其中实时定量 PCR (real-time quantitative PCR) 技术便是一种具有革命性意义的定量 PCR 技术，所谓实时定量PCR 是指在 PCR 指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决 PCR 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。尽管如此，RT-PCR 所使用的光学仪器，因存在体积庞大，价格昂贵等问题，限制了它在临床和研究实验室的使用。因此，发展一种使用快速简单，仪器便携经济并且可用于床边定量检测DNA的分析方法在临床检测中有着广阔的前景。

电化学 DNA 生物传感器是近年来发展起来的一种新型的生物传感器。它能将目的 DNA 的存在转换为电信号，因为本身具有灵敏度高、成本低、易操作、简单化、并能与其它仪器兼容的特点，因而发展非常迅速，同时也使得分析化学和生命科学相结合成了当代科学跨领域研究的趋势。近年来有不少关于电化学传感检测 PCR 扩增产物的报道。但大部分关于电化学传感方法检测 PCR 扩增产物都需要使用到修饰探针的电极或者是应用不对称 PCR 扩增技术，目的就是为了生成一条互补的单链目标产物，从而可以电极面上的修饰探针相互杂交进行检测。在电极面上修饰探针不但操作复杂耗时，同时也增加了传感器构造的费用。而使用不对称或者固相 PCR 扩增技术扩增的效率明显不如常规液相中对称 PCR 扩增的效率和特异性来得高。有研究表明，在最佳优化条件下，液相中对称 PCR 扩增效率可达90%左右，不对称 PCR 扩增的效率仅为70%，而固相上对称PCR 扩增的效率也比液相中对称 PCR 扩增效率低20-30%。本发明选取亚甲基蓝（MB）作为电化学DNA指示剂，使用未修饰探针的裸电极实现对对称PCR扩增产物进行检测，能够很好地解决上述问题。

MB 作为一种电化学指示剂，由于其与双链 DNA(ds-DNA) 与单链DNA(ss-DNA)有着不同的亲和力，已经被广泛地应用于电化学传感器检测DNA杂交反应。有研究表面 MB 可以与DNA中的G 碱基特异性结合，从而使得修饰有DNA探针的电极面上可以检测到一定的电流信号，当杂交进行后，MB 难以接触到ds-DNA中的 G 碱基，所以电流信号减小。

下面所述为本发明人率先提出以 MB 作为电化学 DNA 杂交指示剂，将PCR技术与电化学传感技术相结合，首次设计了一种基于亚甲基蓝DNA指示剂技术的定量检测 PCR 扩增产物的电化学安培电流测定方法。在 PCR 扩增目标 DNA序列的同时，以MB作为杂交指示剂，对 PCR 扩增产物进行电化学安培电流强度检测。该方法通过检测电信号大小的变化，确定体系中是否有 PCR 扩增产物生成，同时还对不同循环数的 PCR 扩增产物量进行测定。该方法与传统方法比较更为简便、快捷、经济、灵敏。

发明内容

本发明目的在于提出一种操作过程简单、检测成本低廉且检测结果灵敏准确的DNA指示剂定量检测PCR产物的电化学方法。

本发明的目的是这样实现的，所述的一种基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，为基于亚甲基蓝DNA指示剂技术检测基因PCR扩增产物的电化学安培电流测定方法，通过亚甲基蓝的电流强度的变化实现实时监测基因扩增过程中PCR扩增产物数量的变化或者实现对扩增终产物的定量测定。