[发明专利]一种耐热的重组别藻蓝蛋白β亚基突变体

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是一种耐热的重组别藻蓝蛋白β亚基突变体。

背景技术

别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）藻类重要的色素蛋白，与藻红蛋白、藻蓝蛋白和连接蛋白等一起构成藻胆体，具有光能捕获和传递的作用。每分子的别藻蓝蛋白含有两条结构相似的多肽链α和β，α亚基和β亚基分别含有约160～180个氨基酸残基，二者的比例通常为1:1。每个亚基上分别共价连接有一个藻蓝胆素（PCB）色基，使别藻蓝蛋白具有特定的吸收光谱，λmax≈650nm。目前，别藻蓝蛋白已获得高纯度晶体，并通过高分辨率的X-射线晶体衍射确定了高级结构，别藻蓝蛋白是（αβ）3三聚体，美国结构生物学合作研究协会的蛋白质数据库（http://www.pdb.org/）已经收录了5个别藻蓝蛋白的高级结构。别藻蓝蛋白作为一种天然的荧光试剂，拥有诸多优点：1、别藻蓝蛋白在含水环境中高度可溶，非特异性结合的影响小。2、别藻蓝蛋白所发荧光为远红光，不为其它生物物质自发猝灭；3、别藻蓝蛋白的荧光激发和发射的斯托克斯位移较大;4、藻胆蛋白易于与其它分子结合，形成多种交联体可以用位于可见光区的单一激发光激发，发射不同颜色的荧光。

别藻蓝蛋白作为荧光试剂也存在一些不足：1、从藻类提取别藻蓝蛋白工艺复杂，成本高，价格昂贵，如Cyanotech等公司别藻蓝蛋白售价高达5000-35000美元/克（参：http://www.phycobiliprotein.com）；2、尤其是，别藻蓝蛋白在高度稀释时解离为单体，造成别藻蓝蛋白光谱畸变。专利“一种制备别藻蓝蛋白荧光蛋白质的方法，200710029673.X”，“一种别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法（申请号：200810157782.4）”，提供了一种利用基因工程方法生产制备重组别藻蓝蛋白亚基的方法，相对于天然别藻蓝蛋白，重组别藻蓝蛋白亚基属于蛋白单体，不存在单体和多聚体之间的变化。但是这类重组蛋白质的热稳定性较低，在与核酸交联制备荧光探针过程中容易失活，热稳定下差限制了其应用范围。

体外分子定向进化属于非理性设计，是指在实验室通过模拟达尔文自然进化的过程，针对某一蛋白质的编码基因，通过诱变技术构建突变体库，然后在一定的筛选压力下，获得某些特性得以改善或提高的突变体。体外分子进化在提高蛋白质热稳定性方面取得了很大的成功。

大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，外源基因表达水平高，抗污染能力强等特点，是分子生物学和生物技术产业化过程中重要的工具。

发明内容

本发明目的在于提供一种耐热的重组别藻蓝蛋白β亚基突变体。

本发明采用的技术方案为：

一种耐热的重组别藻蓝蛋白β亚基突变体，所述突变体为野生型嗜热藻（Thermosynechococcus elongtus BP-1）别藻蓝蛋白β亚基（holo-ApcB）的43位、45位和143位中的一种或几种位点的突变。

所述野生型嗜热藻（Thermosynechococcus elongtus BP-1）别藻蓝蛋白β亚基（holo-ApcB）的Val-43突变为Thr。

所述野生型嗜热藻（Thermosynechococcus elongtus BP-1）别藻蓝蛋白β亚基（holo-ApcB）的Ser-45突变为Ala。

所述野生型嗜热藻（Thermosynechococcus elongtus BP-1）别藻蓝蛋白β亚基（holo-ApcB）的Ala-143突变为Pro。

由亲本嗜热藻（Thermosynechococcus elongtus BP-1）别藻蓝蛋白β亚基（holo-ApcB）进行体外分子定向进化，通过易错PCR和定点突变，获得别藻蓝蛋白β亚基43位、45位和143位中的一种或几种突变组合的突变体。

所述用于表达所述突变体的表达载体为大肠杆菌表达载体；宿主细胞为大肠杆菌。

另，以65℃下半衰期t₅₀来表示，由下表可知各个突变体的热稳定性较亲本得到了提高。

表1突变体氨基酸突变位点及其半衰期

本发明的有益效果：本发明运用易错PCR、定点突变等方法对嗜热藻别藻蓝蛋白β亚基体外定向进化，获得了嗜热藻别藻蓝蛋白β亚基突变体，以半衰期t₅₀表示，突变体的热稳定性得到了提高。

具体实施方式

热稳定性提高的别藻蓝蛋白β亚基（holo-ApcB）突变体：