[发明专利]SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测类猪圆环病毒P1的引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种类猪圆环病毒P1(即是类猪圆环病毒2型因子P1，见温立斌等，一株类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列测定与分析，中国农业科学，2010年02期，411~416)的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测引物，属于分子生物学领域。

背景技术

猪圆环病毒（porcine circovirus, PCV）属于圆环病毒科，圆环病毒属，为单股环状DNA病毒，是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，可引起圆环病毒相关疾病，其中最重要的是猪断奶后多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）。本病最早发现于加拿大（1991），很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行，除PMWS外，PDNS（猪皮炎与肾病综合征）、PNP（增生性坏死性肺炎）、PRDC（猪呼吸道疾病综合征）、繁殖障碍、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。此外，PCV2感染可导致机体免疫抑制，引起免疫失败以及继发感染，给养猪业造成严重的经济损失。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为引起猪免疫障碍的重要传染病(Segale′s等 Porcine circovirus diseases . Anim Health Res Rev, 2005, 6: 119–142)。

    类猪圆环病毒P1是新近发现的病毒，可引起感染猪出现类似PMWS症状（Wen 等 A novel porcine circovirus-like agent P1 is associated with wasting syndromes in pigs. PLoS ONE 2012, 7(8): e41565）。它不仅拥有单股环状DNA基因组，而且其核苷酸序列大部分与PCV2的高度同源（Wen 等 Complete genome sequence of a novel porcine circovirus-like agent. J Virol. 2012, 86(1): 639）。SYBR Green I是一种双链DNA结合染料，其特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。与其他实时荧光定量PCR技术相比，SYBR Green I在核酸的实时检测方法有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，而且通过融解曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，区分非特异性扩增。由于P1拥有与PCV2高度同源的序列，目前报道的诊断P1的定量PCR方法尚无法鉴别P1和PCV2，只能结合普通PCR结果综合判断(温立斌等SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1.华北农学报.2009，4：31-35)。本发明利用反向PCR原理，设计新型特异性引物，采用的绝对定量技术，为样本中类猪圆环病毒P1载量消长规律等方面的研究提供方法，为P1流行病学监测、致病机理的研究提供技术支持。同时还可区分P1与PCV2的感染提供技术平台。

发明内容

技术问题

本发明的目的是克服现有技术中存在的上述不足，提供一种类猪圆环病毒P1的荧光定量PCR检测引物和方法。该方法的检测灵敏度可达10¹个拷贝的病毒分子，具有良好的特异性和重复性。不仅可对P1进行定量，还可对PCV2定性加以鉴别，从而为类猪圆环病毒P1的检测和监控提供有效方法。

技术方案

一种类猪圆环病毒P1的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于，

上游引物： 5' AAGACCCCCCACTTAAACCC 3' ；

下游引物： 5' GAGAGGCGGGTGTTGAAGAT 3'

其目的扩增片段为119 bp，扩增序列具体如下：     AAGACCCCCCACTTAAACCCTAAATGAGGATCCACTAGTAACGGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGCTACCGTTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC。

所述的引物用于类猪圆环病毒P1的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法为： 

（1）定量标准质粒的构建与制备