[发明专利]大观霉素快速时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及食品中有害残留物的检测方法，特别是大观霉素定量检测的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。 

背景技术

大观霉素（英文名Spectinomycin）是一种氨基环醇类化合物，由链霉Streptomyces 

spectabilis分离而得，主要存在于动物性产品的组织和肝脏内，可损害第八对脑神经，有肾脏毒性及对神经肌肉的阻断作用。

欧盟2002年颁布了关于大观霉素在组织中的最大残留限量（残留标示物均为原形）。所有食品动物的肌肉、脂肪、肝、肾中大观霉素的最大残留限量分别为300 μg/kg、500 μg/kg、1000 μg/kg和1500 μg/kg我国农业部于2003年也颁布了关于大观霉素在组织中的最大残留限量，大观霉素在牛/羊/猪/鸡的肌肉、脂肪、肝、肾中最大残留限量分别为500 μg/kg、2000 μg/kg、2000 μg/kg和5000 μg/kg。因此加强对大观霉素残留检测技术的研究，是有效控制动物组织中药物残留的关键措施，也是建立和完善药物残留监控体系的任务之一。 

目前的免疫层析（lateral flow immunoassay，LFIA）快速检测试纸条多以胶体金、彩色乳胶微球或者荧光素作为标记物。基于胶体金标记技术开发的快速检测产品，存在定性或者半定量，批间差异较大等问题；彩色乳胶微球虽然批间差有所改进，但灵敏度依然较低，也只能定性或半定量；基于荧光素标记技术的免疫层析灵敏度有了较大提高，也能进行定量检测，但是由于样本中含有较高的荧光本底信号，且stock位移较小，会对检测产生较大的影响。 

时间分辨荧光（Time-resolved Fluorescence，TRF）是一种非同位素荧光标记物，与普通荧光相比，具有stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。 

本发明利用Fusion5替代传统的样品垫、滤血膜、结合垫，将原有的四层甚至五层膜系统简化，开发出只需要三层膜结构的快速定量免疫层析检测试纸，不仅使生产工艺得到了简化，而且有效的降低了产品的批内差和批间差，提高了检测灵敏度，极具实用价值。 

发明内容

本发明的目的是为了提供新型的、能快速定量检测大观霉素的时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法和应用。 

本发明一方面公开了大观霉素时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，该试纸条包括Fusion5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分。硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端。其中，Fusion5膜上设有加样区和微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球；硝酸纤维素膜上设有检测线（T线）和质控线（C线），T线接上包被大观霉素抗原，C线包被抗兔抗体。 

本发明的优点是能快速检测出肌肉、组织中大观霉素的含量。 

所述大观霉素时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有大观霉素单抗的荧光微球，质控微球为表面包被有兔抗标记蛋白的荧光微球。 

所述荧光微球中填充了斓系元素化合物；较优的，该斓系元索鳌合物为铕鳌合物；最优的，该铕鳌合物可为Eu（TTA）₃/TOPO或Eu（TTA）₃/Phen 。 

所述蛋白可以是牛血清Y - 球蛋白（BGG）或小牛血清白蛋白（BSA）。 

所述时间分辨荧光微球粒径范围为100 - 1000 nm。 

所述硝酸纤维素膜上，T线上包被的抗体为大观霉素单抗，C线上包被的抗兔抗体。 

所述大观霉素时间分辨荧光免疫定量检测试纸条底部设有塑料底板。 

本发明第二方面公开了大观霉素时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条的制备方法，包括以下步骤： 

(1) 质控微球制备：

    ① 用生物素标记蛋白；

    ② 采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球；

    (2) 检测微球制备：采用大观霉素的单抗包被醛基修饰的荧光微球；

(3) 空白大卡粘贴：将硝酸纤维素膜粘贴在塑料底板中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端；