[发明专利]对水稻褐飞虱高毒力的Bt毒素 Cry1Ab-loop2-P2S和工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种对植物害虫具有毒力的毒素和工程菌，具体涉及一种对半翅目水稻褐飞虱高毒力的Bt毒素Cry1Ab-loop2-P2S和工程菌；属生物防治技术领域。 

背景技术

水稻是我国最主要的粮食作物，然而水稻的病虫害繁多，严重影响我国水稻的生产。转Bt基因等抗鳞翅目和鞘翅目害虫水稻的种植，预期可有效地防治这类害虫的危害（Tang et al., 2006; Wang et al., 2010）。同时，也不可避免地带来加重非Bt杀虫蛋白靶标昆虫刺吸性口器害虫如飞虱、叶蝉等危害的可能性（Chen et al., 2011）。因此，创制发展针对稻飞虱等刺吸性害虫的新型昆虫毒素迫在眉睫。 

苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis简称 Bt）是世界上应用最广的微生物杀虫剂。其产生的Cry系列毒素蛋白（δ-Endotoxins）是Bt产生的最重要的毒素蛋白之一，已经被广泛应用于对鳞翅目、鞘翅目、双翅目害虫及植物病原线虫的防治（Arenas et al., 2010）。cry基因也是应用最广的用于转基因作物的杀虫基因。转cry基因农作物（如玉米、棉花、大豆、马铃薯、烟草、番茄、油菜、水稻等）已被大面积种植，有效地控制了鳞翅目与鞘翅目害虫的危害，成为害虫管理的一种重要手段（Rie, 2000; Shelton et al., 2002；Wang et al., 2010）。 

然而，Bt及其所含昆虫毒素对半翅目及同翅目等刺吸性口器害虫无明显毒性，迄今还未发现对这类害虫有显著毒效的Bt株系。鉴于飞虱、叶蝉、蚜虫等刺吸性害虫对农业生产的重大危害及转基因抗虫品种的种植带来的加重刺吸性害虫爆发性危害的现实可能性，迫切需要研发针对此类害虫的新型抗性基因。以cry基因为基础，通过改造Cry毒素分子，开发能够产生针对刺吸性害虫的新型Cry毒素工程菌，是一项具有重大理论和应用价值的研究。 

发明内容

本发明的目的是提供对半翅目害虫水稻褐飞虱具有高毒力的Bt毒素Cry1Ab-loop2-P2S和工程菌。 

以Bt Cry毒素作用模型 Bravo模型（Knowles, B. H. & J. A. Dow., 1993）为理论基础，利用噬菌体短肽文库展示技术筛选出可以和水稻褐飞虱中肠结合的短肽P2S；进一步，将短肽序列利用分子片段替换的方法替换Cry分子Domain Ⅱ的loop2序列，构建出cry1Ab-loop2-p2s毒素基因，将该基因与通用表达载体pGEX-KG（购自GE Healthcare）连接并转化入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21-DE3中，经过稳定性测定、结合活性测定及毒力测定，获得了能够表达对水稻褐飞虱有高毒性作用Cry1Ab-loop2-P2S毒素的工程菌1Ab-P2S，该菌株为人工构建质粒的工程菌，宿主为大肠埃希氏菌（Escherichia  Coli），于2012年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏号为：CGMCC NO：6427。 

    所述loop2序列为Cry分子中决定受体识别的环区，其氨基酸序列为：RRPFNIGINNQ；所述大肠杆菌BL21-DE3菌株由市场购得。所述噬菌体展示技术（phage display）是将基因表达与亲和选择相结合的技术，其基本原理是将编码诱饵蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因进行融合表达，该重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶标蛋白库中与诱饵蛋白相互作用的蛋白质。 

本发明的技术方案，操作步骤如下：

1.      与水稻褐飞虱中肠内膜结合短肽的筛选