[发明专利]一种制备苹果树腐烂病菌转化子及GFP标记菌株的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种苹果树腐烂病菌转化子及其制备方法，同时还提供一种苹果树腐烂病菌GFP标记菌株及其制备方法。

背景技术

黑腐皮壳菌(Valsa ceratosperma)引起的苹果树腐烂病，是对苹果产业威胁最大的一种毁灭性病害，该病在我国苹果产区发生普遍，可造成果树主干及整树死亡，甚至毁园（陈策，1987；2009）。自1916年苹果树腐烂病在辽宁省南部地区发现以来，该病已在我国有过几次大流行，造成了严重的产量和经济损失（陈策等，1980；2009）。随着我国苹果种植结构和栽培制度的调整，腐烂病已成为限制我国苹果产业发展的主要因子。2008年，国家苹果产业技术体系调查显示，全国范围内苹果树腐烂病的总体发生率为52.7%，部分地区发病率高达85%以上（曹克强等，2009）。2011年，山东烟台苹果产区腐烂病再次严重发生，本课题组调查发现，旺盛结果期的苹果树具有新病疤的病株率为68.20%，死株率为2.76%（王彩霞等，2012）。

针对苹果树腐烂病造成的严重危害及防治困难等问题，引起了国内外相关科研工作者及多国政府部门的高度重视，该病现在仍被列为欧洲的主要检疫对象(http://www.eppo.org)。我国自上世纪50年代以来，对苹果树腐烂病的发生和流行规律、防治技术及病原学等进行了系统研究，取得了许多有意义的成果。目前生产上对于腐烂病的防控，采取的措施主要包括加强栽培管理、喷药保护、及时刮治病斑等，但这些措施都未能有效控制病害的发生和流行。其中一个重要原因是对于腐烂病菌的侵染、致病过程与致病机理尚不清楚，制约了对病害发生、流行规律的深入了解，导致病害防治工作低效、盲目和被动，造成腐烂病的危害近年来仍在逐年加重。

植物病原菌侵染致病过程的研究，对于病害防控具有重要的实践价值，可以为施药提供一定的科学依据，如施药时期、施药部位、施药次数等，还可根据抗感病品种不同的侵染过程而筛选抗病品种。对于真菌侵染过程的研究，多采用切片染色结合电子显微镜观察的方法进行，但对于木本植物的枝干类病害如苹果树腐烂病、枝干轮纹病等，由于材料木质化程度高，采用传统的技术方法很难取得理想的观察效果，这也是该类病害侵染致病过程研究无法取得突破性进展的主要原因之一。随着生物技术和分子生物学的不断发展，利用分子标记如绿色荧光蛋白(GFP)研究病原菌的侵染过程与致病机理已成为可能(Spellig et al.,1996)。因此，在目前缺乏有效抗腐烂病品种及杀菌剂的前提下，利用GPF标记菌株揭示腐烂病菌的侵染致病过程及其潜伏位点，明确其致病机理及其与寄主的互作机制，将为苹果树腐烂病的有效、安全控制提供新的指导思路，为生产上科学、高效地防控腐烂病提供坚实的理论基础。

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为一种重要的报告基因，在病原菌的侵染致病过程、病原菌在寄主组织中的发育和形态观察、致病机理及其病原物-寄主互作研究等诸多方面均显示了良好的应用前景(Chen et al.,2003;Dueket al.,2004;Sarrocco et al.,2007;Rajasekaran et al.,2008;Mansouri et al.,2009;Pliego et al.,2009)。在植物病原真菌中，GFP标记技术也已得到广泛应用，并取得了前所未有的成果，受到植物病理学家的高度关注。对于苹果树腐烂病菌而言，由于其功能基因尚未被克隆，因此，要得到其GFP标记菌株，首先必须建立高效、稳定的腐烂病菌遗传转化技术体系。