[发明专利]一种高效获得葡萄藻单细胞的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及高效获得葡萄藻单细胞的方法及其应用。

背景技术

随着全球化石能源的短缺及由于使用化石能源带来的环境问题，寻找新型可替代能源势在必行。微藻具有生物量大、生长周期短及含油脂类物质高等特点，在CO₂减排和生物燃料开发上都有广阔的开发前景。

可利用微藻开发的生物燃料主要两种类型，一类是利用微藻合成的脂肪酸通过酯化生产生物柴油，因大多数微藻通过脂肪酸合成途径可积累大量油脂，故目前多采用此类研发思路来开发微藻生物柴油技术；另一类是利用微藻合成的烷烃类物质生产生物航空煤油，在微藻中，葡萄藻合成的烃类物质与石油性质非常相似，可代替石油用于航空煤油的生产。

航空煤油原本是石油产品之一，是由直馏馏分、加氢裂化和加氢精制等组分及必要的添加剂调和而成的一种透明液体。主要由不同馏分的烃类化合物组成。近些年来，我国航空燃料的需求不断增长。目前，国内航煤消费量保持每年13%左右的增长速度，远高于国际5%的增长水平，2010年国内航煤消费已达到1800万吨以上。现在我国已成为年消费量近2000万吨的航空燃料消费大国，按照有关国际组织预测，2020年生物航煤将达到航油总量的30%。目前国外已有商业化的生物航空煤油产品，而2012年2月我国的首个生物航空煤油产品的适航审定申请也由中国民用航空局正式受理。但该生物航煤是以多种动植物油脂为原料，采用自主研发的加氢技术、催化剂体系和工艺技术生产的。仍然存在生产原料有限，生产工艺复杂，造价高等问题，而用藻类进行生物航空煤油的生产则可以在很大程度上克服这些问题。

如上文所述，藻类中比较适于生物航空煤油生产的是葡萄藻。葡萄藻又名丛粒藻，属绿藻门、四胞藻纲、葡萄藻科、葡萄藻属，显微镜下，葡萄藻呈串状集落生长，细胞梨形，宽5-9μm，长9-13μm，具有明显细胞壁，细胞壁分内外两层，内层由粘性多糖构成纤维状，外层由三层薄层形成鞘；藻体包埋于藻丛中，在外围形成一层透明或半透明的油膜。在透射电子显微镜下可见，围绕着细胞基部的厚基质结构是由连续的细胞分裂产生的外壁构成，借以将藻体细胞的集落粘合起来。常为2个或4个细胞组成一组，各个胶质漏斗在中央互相联合，所有的细胞或多或少地呈辐射状排列。葡萄藻以似亲孢子营无性生殖。葡萄藻的产烃量25%-86%，大部分烃颗粒储存在细胞外壁和折射绍丝中，其分布可能会随培养阶段发生变化。

葡萄藻虽产油率高，但其生长缓慢，室外养殖容易污染，故很难得到大规模的推广应用，优良葡萄藻藻种的选育是克服葡萄藻推广应用的关键环节。而在葡萄藻生长过程中多个细胞聚集成团，在藻种选育上，特别是在基因工程改造上很难操作，这就需要能高效产生高活性葡萄藻单细胞的技术。传统的从细胞群体中获得单细胞的方法主要有机械破碎，超声破碎，酶解等方法，但此类方法多对细胞损伤较大，得到的细胞质量低，生产成本较高，生产效率低，往往不能高效的获得单细胞，获得的单细胞往往是单细胞和原生质体混合物，其中破碎组织占据大部分。另外，葡萄藻的结构特性表明，大部分烃颗粒储存在细胞外壁中，故藻体细胞在油脂提取中成为障碍物，如何去除藻体细胞障碍物成为提高油脂提取率的关键技术。

因此，本领域中需要可高效的获得高活性的葡萄藻单细胞以及葡萄藻胞外组织的方法。

发明内容

本发明的目的在于提出一种获得葡萄藻单细胞以及葡萄藻胞外组织的方法，通过所述方法可以高效地获得高活性的葡萄藻单细胞，同时获取除去了藻细胞的葡萄藻胞外组织，以提高油脂提取率。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种从细胞群体生长的葡萄藻中高效获得大量完整且具有高活性的单细胞方法，其特征在于，所述方法包括去除湿藻藻体细胞表面的部分水分。

本发明的方法可以包括：

（a）收集湿藻藻体；

（b）去除所述藻体细胞表面的部分水分；

（c）形成所述藻体的单细胞和胞外组织的混合物；

（d）任选地，还包括收集所述单细胞。

本发明提供的方法还可以包括：

（a）收集湿藻藻体；

（b）去除所述藻体细胞表面的部分水分；

（c）形成所述藻体的单细胞和胞外组织的混合物；（e）任选地，收集所述胞外组织；和

（f）任选地，从所述胞外组织提取油脂。

在本发明的方法中，去除所述藻体细胞表面的部分水分的步骤可以在5-40℃，优选10-35℃，最优选20-30℃下进行。