[发明专利]诱导的多潜能干细胞分化为软骨细胞的方法

权利要求书

1.一种诱导的多潜能干细胞分化为软骨细胞的方法，包括细胞制备，培养基配制，其特征在于按下列步骤进行：

（1）原代胚胎鼠成纤维细胞的制备，取孕13—14天母鼠子宫中的胎鼠，无菌条件下，将胎鼠去头和内脏后剪成糊状，再经胰蛋白酶消化，收集细胞，接种到含有10%胎牛血清的DMEM培养液的细胞培养瓶中贴壁培养2—3天；

（2）饲养层细胞的制备，复苏冻存的胚胎鼠成纤维细胞，接种到细胞培养瓶中，待细胞有80%—90%融合时，用丝裂霉素C处理，胰蛋白酶消化，在含有10%胎牛血清的DMEM培养液里培养成细胞悬液，计数，按10⁵个/cm²细胞密度接种到0.08—0.12%明胶包被的培养皿中贴壁培养至密度为50—60%汇合为宜，备用；

（3）诱导的多潜能干细胞的未分化扩增培养，复苏冻存的诱导的多潜能干细胞接种到经丝裂霉素C处理的饲养层上，在诱导的多潜能干细胞培养基中培养，所说的多潜能干细胞培养基以高糖DMEM为基础，添加18—22%胎牛血清、0.8—1.2%非必需氨基酸、0.08—0.12mmol/L巯基乙醇、1.8—2.2mmol/L谷氨酰胺、48—54U/ml 青霉素、48—54U/ml链霉素、950—1100U/ml LIF；

（4）细胞微团的获取，诱导的多潜能干细胞经胰酶消化、离心，调成1×10⁷/ml的细胞重悬液，取20μl (2.0×10⁵个细胞)转移到含1.0ml培养基的离心管中，离心，弃上清，所说的培养基为含5—10%体积百分比胎牛血清的DMEM；

（5）软骨细胞的获取，配置软骨细胞诱导培养基：在DMEM培养基中加入5—10%胎牛血清、6—6.5μg/ml胰岛素、10—20ng/ml转化生长因子β1、95—110μmol/ml地塞米松，37—38mg/ml抗坏血酸、0.8—1.2μmol/ml丙酮酸钠、6—6.5μg/ml转铁蛋白；

（6）成软骨细胞诱导：将配置好的成软骨细胞诱导培养基缓慢加入含有细胞微团的离心管中，诱导培养20—23天，每2天半量更换诱导培养液。