[发明专利]ELISpot视神经脊髓炎诊断试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及ELISPot视神经脊髓炎诊断试剂盒及其应用，属于医学免疫学诊断技术领域，具体是关于通过运用ELISpot方法对视神经脊髓炎进行诊断的应用。

背景技术

在已有技术中，视神经脊髓炎(Neuromyelitis Optica，NMO，又称Devic病)病因不明，临床表现多为双侧急性神经炎或球后视神经炎，以及在发生视神经炎的同时或前后发生的脊髓炎所引起的截瘫，病人视力多急剧下降或完全失明，眼底表现为视盘充血、水肿(视神经炎型)或正常眼底(球后视神经炎型)。此外，尚未有瞳孔光反射迟钝和消失、巨大的中心暗点或视野向心缩小灯改变，偶伴有眼外肌麻痹。本病死亡率约50％，多因呼吸肌麻痹或因继发肺及泌尿系统的感染死亡。但目前对这一疾病的检测多依赖于临床诊断，准确率受到主诊医生水平影响极大。

水通道蛋白4(aquaporin-4，AQP-4)属于介导水跨膜转运的水通道蛋白家族成员之一，以极化形式集中分布于中枢神经系统脑毛细血管周边的星形胶质细胞足突或室管膜细胞表面。研究认为，AQP-4广泛存在于蛛网膜下腔、血管周围的胶质细胞、室管膜细胞以及渗透压感受器官，其可调节脑脊液及细胞液体积的功能。Kiening等研究发现，脑缺血72小时后AQP-4的表达与脑水肿成正比上升，而在AQP-4基因敲除鼠模型中脑水肿明显减轻。以上研究表明，AQP-4在脑组织水代谢调节中起关键作用，且参与了视神经脊髓炎的发病过程。最近研究表明，在视神经脊髓炎患者的血清中存在AQP-4的自身抗体，而在多发性硬铭症患者血清中则没有。2006年国际NMO诊断标准将抗AQP-4抗体的检测作为诊断NMO的核心支持条件后，对临床早期确诊NMO，以及和其它脱髓鞘疾病的鉴别诊断具有非常重要的临床指导意义。

在运用15个氨基酸的多肽叠加依次进行AQP-4蛋白的免疫原性分析发现，AQP-4不同的肽段对T细胞的免疫原性不同，其中N端胞内区的22-36氨基酸，跨膜区的82-108/211-225/235-249氨基酸，胞外的139-153和C端胞内区的289-306氨基酸均具有较强的T细胞免疫原性。

1983年建立的酶联免疫斑点实验(Enzyme-linked Immunospot，ELISpot)技术具有高度的敏感性和应用的广泛性，已成为免疫检测抗原特异性免疫反应的重要检测手段之一。本发明即是结合AQP-4抗原结构特点，构建出NMO效应T细胞特异的抗原多肽，利用ELISpot方法对NMO疾病进行诊断。

发明内容

本发明的目的是针对人AQP-4抗原结构的特点，把其免疫原性强的多肽片段(氨基酸23-36和135-155)连接成全新的氨基酸序列，形成多肽抗原，组成ELISpot诊断试剂盒，用于检测视神经脊髓炎患者外周血中分泌的特异性IL-4的T细胞，提高视神经脊髓炎检测的灵敏度和特异性，辅助视神经脊髓炎的诊断和鉴别诊断。

本发明的技术方案是：一种可以用于视神经脊髓炎ELISpot法诊断的多肽片段，其氨基酸序列如下：IMvAFKGVWTQAFWKCLVTP PSVVGGLGVTMVHGNLT。

本发明的另一目的是提供视神经脊髓炎ELISpot诊断试剂盒，其中含有ELISpot检测板、IL-4捕获抗体、AQP-4多肽、生物素标记的IL-4检测抗体、亲和素-碱性磷酸酶结合物、底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3吲哚磷酸。

下面将结合附图说明和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。

附图说明

图1、本图是实施例的检测图谱示例图。实施例共分为3组，分别为健康人群对照组(Control组)、多发性硬化症疾病对照组(MS组)和视神经脊髓炎组(NMO组)。其中，A列为阴性对照孔，B列为多肽检测孔孔，C列为阳性对照孔。从图中可以看出，本发明涉及的多肽在本实施例中完全可以用于NMO疾病的诊断和鉴别诊断。

图2、本图为实施例检测结果的统计图。从图中可以看出，在20例NMO患者中使用本专利的检出17例，检出率为85％.

具体实施方式

运用本发明，对20例健康对照人群(Control组)、20例疾病对照人群(多发性硬化患者，MS组)和20例视神经脊髓炎患者(NMO组)进行鉴别诊断，从而初步判断本发明在视神经脊髓炎诊断中的特异性和敏感性，从而判断其临床意义。

具体步骤如下：

(一)包被：