[发明专利]一种成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因技术领域，尤其涉及一种成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法。 

背景技术

肺纤维化是一种危害人民健康的严重疾病，死亡率高，目前尚无有效的治疗方法。目前研究表明，肺纤维化发生中，上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是其重要的病理生理过程，而成纤维细胞生长因子II型受体(fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2)IIIb剪切体，即角质细胞生长因子受体(Keratinocyte Growth Factor Receptor，KGFR)，其表型的丢失是EMT发生的关键。目前，还缺乏成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，为肺纤维化提供基因治疗的方法。 

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，旨在解决目前还缺乏成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，不能为肺纤维化提供基因治疗的方法的问题。 

本发明实施例是这样实现的，一种成纤维细胞生长因子II型受体IIIb剪切体的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤： 

FGFR2 IIIc表达载体的获得与测序鉴定； 

FGFR2 IIIb 3-11外显子片段的获得； 

FGFR2 IIIb腺病毒表达载体的构建； 

FGFR2 IIIb腺病毒的包装。 

进一步，所述FGFR2 IIIc的插入位点为5’XbaI/3’Hind III；采用Xba/Hind III从pRK5中切下FGFR2I IIc，同样酶切位点插入pBluescriptII-SK质粒；采用通用引物T3、T7对FGFR2 IIIc进行了测序分析，通过与Pubmed公布的基因序列进行比对，证明目的基因片段确为FGFR2 IIIc。 

进一步，所述FGFR2 IIIb 3-11外显子片段的获得方法： 

依据Pubmed公布的基因序列，通过对FGFR2 IIIb及IIIc mRNA表达序列的分析，可以得知Pst I与Nhe I两个唯一的酶切位点分别位于FGFR2的外显子3与11上，SK载体上的Pst I已在FGFR2 IIIc片段插入时消失； 

取小鼠肺提取总RNA，采用引物P1(forward)5’-ttg tac tgc agc tag gacgg-3’与引物P2(Reverse)5’-aac tca tac tcg gag acc cc-3’进行RT-PCR扩增出FGFR2 exon3至exon11之间的片段。通过胶回收法，提取目的片段； 

采用TA-Clone法扩增目的片段，扩增结果通过酶切法鉴定；在TA-Clone的PUC19载体上有一个EcoR V酶切位点，而在FGFR2外显子3到11片段上，仅在外显子9上有一个EcoRV酶切位点，因此，扩增产物如有2条带即为FGFR2IIIc部分，如只有一条带，即为FGFR2 IIIb； 

用Pst I与Nhe I从PUC19上切取FGFR2 IIIb外显子3到11片段，并取代SK载体上的FGFR2 IIIc上的外显子3到11片段，从而得到完整的FGFR2 IIIb表达载体； 

该FGFR2 IIIb表达载体同样采用通用引物T3、T7对外显子3-11部分进行了测序分析，并与前述FGFR2 IIIc测序结果进行了比对分析，证实了我们所得载体确为FGFR2 IIIb表达载体。 

进一步，载体内FGFR外显子3至外显子11的序列测序结果如下：