[发明专利]一对丽蚜小蜂特异性SCAR引物及快速PCR检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及一对丽蚜小蜂特异性SCAR引物及快速PCR检测方法和试剂盒。

背景技术

丽蚜小蜂Encarsia formosa Gahan，属膜翅目、蚜小蜂科、恩蚜小蜂属，是烟粉虱、温室粉虱的主要寄生性天敌之一。丽蚜小蜂于1927年首次在英国发现并用于防治温室粉虱，此后，欧洲各国便开始利用丽蚜小蜂防控温室粉虱的研究。如英国的英格兰和威尔士地区，在1976年应用丽蚜小蜂防治温室粉虱的面积就已经达到139.4ha.，约占当时温室种植番茄、黄瓜面积的72%，并取得了令人满意的结果，防效达72~87%。我国于1978年由中国农业科学院生物防治研究室从英国引进丽蚜小蜂，之后对该蜂的生物学和生态学习性及其与寄主之间的关系等进行了系列研究，丽蚜小蜂的商品化生产技术、田间应用方法及效果评价模式等日臻成熟，并取得了很好的防治效果。如，当温室粉虱种群密度为0.5头/株时，每平方千米释放15万头丽蚜小蜂（分3-4次释放），其防治效果可达95.4%。由于丽蚜小蜂具有安全性能高、控害效果好、适应能力强且成本低廉等特点，目前已成为世界广泛商品化的用于防治温室作物粉虱不可或缺的重要寄生性天敌种类。

丽蚜小蜂体型微小，成虫体长0.59~0.68mm，与其他常见的寄生蜂种类如浅黄恩蚜小蜂、海氏桨角蚜小蜂等形态相似，而且成虫前的各个虫态（包括卵、幼虫、蛹）均在寄主体内度过。鉴于粉虱类害虫的寄生蜂种类较多，而丽蚜小蜂是其重要寄生性天敌之一，因此快速准确地识别丽蚜小蜂是其寄主谱确定及其对不同种类粉虱控制效果评价的必要前提。目前国际上用于丽蚜小蜂鉴定的方法主要有：1）形态特征鉴定；2）AFLP技术等。但目前国内针对丽蚜小蜂尚没有标准的检测方法。

AFLP技术曾用于丽蚜小蜂及其近缘种鉴别。AFLP技术是RFLP技术与PCR技术相结合的产物，亦即，先行利用限制性内切酶水解基因组DNA，使之产生不同大小的DNA片段，然后再使双链人工接头的酶切片段相连接，并以此作为扩增反应的模板DNA；之后，以人工接头的互补链作为引物进行预扩增；最后，在接头互补链的基础上添加1~3个选择性核苷酸作为引物，并对模板DNA再次进行选择性扩增，之后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，并根据扩增片段长度的不同检测出多态性。SCAR-PCR技术检测是在RAPD技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点。

发明内容

本发明的目的为提供一对丽蚜小蜂特异性SCAR引物。

本发明的再一目的为提供一种丽蚜小蜂特异性片段。

本发明的另一目的为提供一种丽蚜小蜂的特异性快速检测方法。

本发明的再一目的为提供一种丽蚜小蜂的特异性快速检测试剂盒。

本发明根据丽蚜小蜂的基因组DNA序列，设计一对种特异性引物，该引物只对丽蚜小蜂具有扩增能力。是对丽蚜小蜂AFLP技术检测方法的补充和改进。同时，本发明采用SCAR PCR技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在丽蚜小蜂监测检测方面具有重要的应用价值，可以试剂盒的形式在保护地及露地丽蚜小蜂种类鉴别、寄主谱筛选及其有效利用中推广。

根据本发明的一对丽蚜小蜂特异性SCAR引物为：

引物EFZZF：5′-AATCGTCGTGTCAGGGAG-3′(SEQ ID No.1)；和

引物EFZZR：5′-GCCGTGGCGTTTAGTATG-3′(SEQ ID No.2)。

根据本发明的丽蚜小蜂种特异性检测方法包括使用上述SCAR引物进行PCR扩增的步骤；或者包括使用探针与上述特异性片段进行杂交的步骤。

根据本发明的丽蚜小蜂种特异性检测试剂盒包括上述丽蚜小蜂特异性SCAR引物，和/或用于检测上述特异性片段的探针。本领域普通技术人员利用分子杂交技术进行丽蚜小蜂种特异性检测时，可以根据本领域的公知常识设计与本申请的丽蚜小蜂特异性片段（SEQ ID No.3所示）特异性杂交的探针。

本发明的丽蚜小蜂种特异性SCAR引物及快速检测方法，用于快速检测丽蚜小蜂。与国际现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：

1）检测准确性高。本发明根据丽蚜小蜂种特异性SCAR标记设计的引物EFZZF和EFZZR，在PCR快速检测丽蚜小蜂时，可扩增出287bp的片段，不仅对丽蚜小蜂的单头成虫、蛹和3龄幼虫可以进行检测，对于单粒卵也能准确检测。