[发明专利]尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法。

背景技术

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（下简称为NAD）为生物体内非常常见的一种脱氢酶的辅酶。脱氢酶在生物体的新陈代谢中起到了决定性的作用，一些生物体基本的代谢运动，比如蛋白质分解，碳水化合物分解，脂肪分解，离开了脱氢酶，就不能正常进行，生物就会失去生命的体征。由于脱氢酶必须与NAD结合才能促使代谢运作，所以是NAD生物体代谢中不可缺少的物质。

NAD是现代生物催化反应必不可少的辅酶之一。现代的生物催化技术模拟了生物体内利用酶来完成的反应，这种反应的模拟条件是严格根据生物体内的代谢特征来进行的，所以像常见的亮氨酸脱氢酶、甲酸铵脱氢酶、葡萄糖脱氢酶催化的手性还原都需要NAD的帮助来完成整个反应，氧化反应亦是如此。而在材料、化工、食品、制药工业中，氧化还原反应（特别是手性还原）是数目最庞大、研究最深入、工艺最成熟的一类反应，所以工业领域对NAD的需求是巨大的。

关于NAD的制备方法的报道很多，主要有酵母提取和化学合成两类。

从酵母中提取是目前工业上大量使用的NAD的主要来源，此法虽然工艺成熟，但设备庞大，浓缩耗能高，且在提取过程中用到了含银盐或者含Hg(COOCH₃)₂等重金属离子的试剂，因此生产效率低，成本高。

化学合成法由于转化率低，所用试剂昂贵，且有大量的过硅胶柱和凝胶色谱柱的操作，目前还停留在实验室研究阶段，只能进行毫克级或克级制备。

综上所述，现有的各种制备NAD的方法还难以很好地满足商业化生产的要求。

发明内容

本发明提供了一种化学法和酶法相结合制备尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其以1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖为起始原料，依次通过缩合反应、氨解反应、磷酸化反应制备尼克酰胺单核苷酸；然后将制得的尼克酰胺单核苷酸与腺嘌呤核苷三磷酸混合，在烟酰胺核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸酶存在的条件下发生酶催化反应，制得尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的酶催化反应中，反应物尼克酰胺单核苷酸与腺嘌呤核苷三磷酸的摩尔比为1:1～1:4。

所述的烟酰胺核苷酸腺苷转移酶为酶冻干粉形式的烟酰胺核苷酸腺苷转移酶，其适用浓度为1～10g/L，或者是含酶细胞形式的烟酰胺核苷酸腺苷转移酶，其适用浓度为10～100g/L；

所述的焦磷酸酶为酶冻干粉形式的焦磷酸酶，其适用浓度为1～10g/L，或者是含酶细胞形式的焦磷酸酶，其适用浓度为10～100g/L。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的酶催化反应中，尼克酰胺单核苷酸的浓度为6g/L～72g/L，腺嘌呤核苷三磷酸浓度为8g/L～96g/L；

所述的烟酰胺核苷酸腺苷转移酶为酶冻干粉形式的烟酰胺核苷酸腺苷转移酶，其适用浓度为1～10g/L，或者是含酶细胞形式的烟酰胺核苷酸腺苷转移酶，其适用浓度为10～100g/L；

所述的焦磷酸酶为酶冻干粉形式的焦磷酸酶，其适用浓度为1～10g/L，或者是含酶细胞形式的焦磷酸酶，其适用浓度为10～100g/L。

在本发明的一个具体实施方案中，所述酶催化反应所用的烟酰胺核苷酸腺苷转移酶（NMNAT）来源于Methanococcus jannaschii，焦磷酸酶（PPase）来源于Saccharomyces cerevisiae，这两个酶可以都通过E.coli克隆表达获得，可通过发酵大量制备，是相对易得和廉价的催化剂，其具体存在形式包括酶液、酶冻干粉、含酶细胞以及各种固定化酶和固定化细胞。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的酶催化反应在pH值为4～8的磷酸盐缓冲液中进行。优选的，pH值为5～7。

在本发明的一个具体实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度20~200mM。优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50~100mM。

在本发明的一个具体实施方案中，所述酶催化反应完成后，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的分离纯化包含以下依次进行的步骤：超滤、过LX-90大孔树脂柱、水洗脱、冻干。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的缩合反应中，以1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖为基准，反应物三氟甲磺酸三甲基硅脂的反应当量为2:1～1:2，反应物烟酰乙酯的反应当量为1:1～1:3；所述缩合反应的温度为0~60℃。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的缩合反应的时间为4~12小时。