[发明专利]一种锦鲤疱疹病毒核酸疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及一种锦鲤疱疹病毒核酸疫苗，属生物技术领域。

背景技术

锦鲤疱疹病毒病(Kio herpesvirus disease,KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus,KHV)引起锦鲤、鲤鱼及其普通变种如框镜鲤等发病的一种具有高度传染性和致死性的疾病。

该病于1998年首次在以色列的Magan Michael地区和美国爆发，2000年该病传至英国、德国和比利时；2002年4月，印尼发生本病，同时中国广东省锦鲤疑似发生本病；同年12月我国台湾省证实锦鲤感染本病；2003年10月日本证实该病已在本国存在。目前，该病在我国的鲤鱼养殖中发病较多，造成鲤鱼的大量死亡，给鲤鱼养殖业带来了几乎毁灭般的打击。尽管有多种传统疫苗可用于疾病的免疫预防，但在生产实践中以及我们的试验研究结果均表明，利用灭活苗来免疫预防锦鲤疱疹病毒病不能起到完全免疫保护作用，同时在我国尚未见有分离出或研究出KHV弱毒株病毒的报道，因此亟待有该病毒的新型疫苗问世。

核酸疫苗(Nucleic acid vaccine)又称基因疫苗、DNA疫苗，它是利用DNA重组技术将保护性抗原蛋白基因克隆到真核表达载体，并将其直接导入体内，使抗原蛋白内源性表达递呈给免疫系统，诱发机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。ORF81基因表达主要囊膜蛋白，是KHV囊膜的重要组成部分，可构成病毒主要抗原决定簇；其功能与诱导病毒与细胞融合、病毒对细胞的吸附和穿入以及在细胞核膜出放有关。本专利以ORF81基因为目的基因，pIRES-neo为真核表达载体，构建了pIRES-ORF81真核表达重组质粒，并研究其免疫效力，研制出高效、新型KHV核酸疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有良好免疫原性的锦鲤疱疹病毒核酸疫苗。

本发明所提供的锦鲤疱疹病毒核酸疫苗，是将ORF81基因克隆到真核表达载体pIRES-neo中得到pIRES-ORF81重组质粒。

其中，所述ORF81基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

本发明利用将编码锦鲤疱疹病毒的ORF81基因定向克隆到真核表达载体pIRES-neo中，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒DNA经限制性核酸内切酶鉴定证实含有正确的ORF81基因。用SDS碱裂解法大量提取质粒，通过罗氏FuGENE HD转染试剂将重组质粒导入框镜鲤尾鳍细胞(MFC)内，收集转染48小时后的MFC细胞，用Western-blot方法检验目的基因的蛋白表达情况，证明所构建的真核重组表达质粒成功在MFC细胞中得到了表达。重组表达质粒进行肌肉注射健康鲤鱼，每14天免疫一次，共免疫3次，每周心脏采血，利用ELISA方法检测鲤鱼血清中的KHV特异性抗体。用ORF81重组质粒免疫的鲤鱼血液中可检测到KHV的特异性抗体，加强免疫后抗体水平随免疫次数的增加而增高。采用固定病毒稀释血清方法，测定ORF81重组质粒免疫后各试验组鲤鱼血清中抗KHV中和效价，ORF81重组质粒免疫组鲤鱼血清均产生了明显的中和抗体。第三次免疫后两周用100TCID₅₀的KHV对各组鲤鱼胸腔攻毒，免疫后的鲤鱼保护率显著提高。对每组鲤鱼进行病理切片，显示免疫鲤鱼大大提高了感染后腮、肾、脾、肝的病理状况。

其中，本发明所用锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ）和框镜鲤尾鳍原代细胞(MFC)均由吉林农业大学动物科技学院实验室保存提供。

本发明的有益效果：本发明的锦鲤疱疹病毒核酸疫苗容易生产，在大肠杆菌中可高效克隆；稳定性强，可在大肠杆菌中长期严格复制克隆；在鱼体内使用安全，由于是真核载体表达保护性抗原所以不会造成病毒扩散；免疫剂量小，所发明的核酸疫苗对鲤鱼进行免疫后，载体高效表达，确保了抗原高效持续表达并分泌到胞外，所以免疫剂量极小。

本发明的核酸疫苗目前已在鲤鱼上进行试验，取得了非常明显保护效率。如果用该疫苗免疫鱼，必将大大减少鱼患锦鲤疱疹患病机率，保证鱼的产量和质量。本发明能使鱼建立针对锦鲤疱疹病毒病有效的抗病机制，使养殖户减少经济损失。同时减少药物使用量，从而保证水产品的质量，维护生态稳定性。使用本发明具有重要的经济效益、社会效益和生态效益。

附图说明

图1：锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ）的ORF81基因PCR扩增电泳图，其中M为DNA分子质量标准，2为ORF81基因PCR产物；