[发明专利]一种筛选蛋白酶抑制剂的方法

权利要求书

1.一种蛋白酶抑制剂筛选方法，其特征在于，包括步骤：

（1）将待测物添加到蛋白酶溶液中混匀；同时设未添加待测物的蛋白酶溶液为空白对照；

（2）步骤（1）的含待测物的蛋白酶溶液和空白对照中分别加入底物蛋白溶液进行反应，得到反应液；

（3）反应液中加入反应终止液；

（4）再加入茚三酮反应液进行反应；

（5）加入双蒸水，根据吸光度值OD_570nm判断结果，若含待测物溶液的吸光度低于空白对照，则待测样品为阳性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶为基质金属蛋白酶或胰酶。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中蛋白酶溶液制备方法为：将浓度为1mg/ml的蛋白酶水溶液与反应缓冲溶液按体积比为1:16~30混合得到蛋白酶溶液；步骤（2）中底物蛋白溶液的制备方法为：15-30mg/ml的底物蛋白水溶液与反应缓冲溶液按体积比为1:5~10混合得到底物蛋白溶液。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反应缓冲液为含50mMTris-HCl，100~250mM NaCl，1~5mM CaCl₂，1μM ZnCl₂，pH=7.5；

或50mM Tris-HCl，100~250mM NaCl，1~5mM CaCl₂，1μM ZnCl₂，pH=7.5，含有3%~6%聚乙二醇。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，当蛋白酶溶液和底物蛋白溶液中含有聚乙二醇时，步骤（3）所述反应终止液为25~100mM的EDTA-Tris-HCl缓冲液；

当蛋白酶缓冲溶液和蛋白缓冲溶液中没有聚乙二醇时，步骤（3）所述反应终止液为25~100mM的EDTA-Tris-HCl缓冲液，含12%~20%聚乙二醇。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述的茚三酮反应溶液由溶液A和溶液B等体积混合得到，

所述溶液A为氯化亚锡-柠檬酸钠溶液，含0.1~0.3M柠檬酸，7~10mM氯化亚锡，用氢氧化钠调pH值为5.0；

所述溶液B为茚三酮-二甲基亚砜溶液、茚三酮-乙二醇溶液或茚三酮-N,N-二甲基甲酰胺溶液，即将茚三酮溶解于二甲基亚砜或溶解于乙二醇，或溶解于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，使茚三酮终浓度为40~70g/L。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中茚三酮反应液按体积比5~8:1加到步骤（3）的混合溶液中。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）反应条件为80-100℃，10-15min，pH=5.0。

9.权利要求1~8任一所述的方法在制备抑制肿瘤侵袭、转移的药物中的应用。

10.一种筛选蛋白酶抑制剂的试剂盒，其特征在于，含有茚三酮反应溶液、反应缓冲液、反应终止液；

所述的茚三酮反应溶液由溶液A和溶液B等体积混合得到；

所述溶液A为氯化亚锡-柠檬酸钠溶液，含0.1~0.3M柠檬酸，7~10mM氯化亚锡，用氢氧化钠调pH值为5.0；

所述溶液B为茚三酮-二甲基亚砜溶液、茚三酮-乙二醇溶液或茚三酮-N,N-二甲基甲酰胺溶液，其为将茚三酮溶解于二甲基亚砜溶液或乙二醇溶液或N,N-二甲基甲酰胺溶液中，使茚三酮终浓度为40~70g/L；

当所述反应缓冲液为50mM Tris-HCl，100~250mM NaCl，1~5mM CaCl₂，1μM ZnCl₂，pH=7.5时，

所述反应终止液为25-100mM  的EDTA-Tris-HCl缓冲液，含有12%~20%聚乙二醇；或

当所述反应缓冲液为50mM Tris-HCl，100~250mM NaCl，1~5mM CaCl₂，1μM ZnCl₂，pH=7.5，含有3%~6%聚乙二醇时；

所述反应终止液为25-100mM的EDTA-Tris-HCl缓冲液。