[发明专利]一种阴沟肠杆菌特异性PCR检测引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测的引物，具体涉及一种用于检测阴沟肠杆菌PCR检测的引物，属于生物检测技术领域。

背景技术

阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)为革兰氏阴性菌，广泛存在于自然界中，在人和动物粪便、土壤、植物、昆虫中均可检出，它是人和动物肠道正常菌种之一，同时它也是一种重要的条件致病菌。近年来，由于第三代和第四代头孢菌素、碳青酶烯类等超广谱抗菌药物在临床上的广泛使用，使该菌在其选择压力下不断发展耐药机制，耐药菌株日益增多，已成为重要的医院感染病原菌，其引起的细菌感染性疾病常累及多个器官，包括皮肤软组织感染、泌尿系统感染、呼吸道感染以及败血症等。已有研究报道，阴沟肠杆菌作为条件致病菌不仅对人具有致病性，同时还对鱼类具有致病性。近年来，本课题组反复研究发现该菌对罗氏沼虾幼体具有极强的致病性，发病幼体主要表现为不吃食、无活力、应激强烈、成活率低。由于该菌的影响，导致许多罗氏沼虾育苗单位育苗不顺，严重者无法出苗，造成的经济损失巨大。在不明病原菌的情况下，滥用药物，一则针对性不强，效果不明显；二则导致细菌耐药性增强。因此，临床上迫切需要一种快速、精准的检测手段，辨明病原，针对防治。

传统的细菌鉴定方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，需要大量的时间进行生理生化反应的结果判读，不利于及时诊断病因，查找病原，控制病情蔓延。PCR技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，已逐步应用于细菌的快速检测。已有学者以DnaJ为靶基因建立了阴沟肠杆菌real-time PCR检测方法，但该法的特异性不强。此外，与普通PCR相比real-time PCR需要实时荧光定量PCR仪，且实验成本与实验技术等要求都相对较高。因此，该法在基层使用具有一定局限性。经对现有技术的文献检索发现，尚未发明与本发明的阴沟肠杆菌PCR检测方法、核酸及引物相关报道。本发明建立的检测方法可为临床上阴沟肠杆菌快速诊断和流行病学调查提供技术支撑。

发明内容

 本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种阴沟肠杆菌PCR检测引物。该引物可用于产气肠杆菌的PCR检测，具有检测时间短，成本低，检测结果特异性高，结果易判断，实用性强。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

一种阴沟肠杆菌特异性PCR检测引物，包括正向引物和反向引物：

正向引物F：5’-CATGACACCGGTGTTTCCCCAGT-3’

反向引物R：5’-CGGTCGGTGAAGCCCAGAACCACTA-3’。

所述引物在用于产气肠杆菌的PCR检测时，具体如下操作：

步骤一，提取样品DNA，PCR法扩增；

PCR检测体系为20 μL的反应体系，具体为：

10×PCR buffer(含Mg²⁺)    2 μL，

2.5mmol/L的dNTP       1.6 μL，

5 U/μL 的rTaq酶        0.16 μL，

20 μM的引物对          0.8 μL，

模板DNA               1-2 μL，

最后用灭菌双蒸水补至20 μL；

PCR检测反应程序为：94℃预变性4min；进入循环，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min，降温至4℃，结束。

步骤二，取10μL PCR扩增产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测，判断样品种是否含有阴沟肠杆菌；所述判断具体为：1%凝胶电泳电泳检测扩增产物，若电泳结果在385bp出现单一条带，则说明样品种含有阴沟肠杆菌；反之，则样品中不含阴沟肠杆菌。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：采用本发明的检测方法检测阴沟肠杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。同时，本发明所涉及的仪器设备、试剂等较为常用，一般基层实验室即可开展检测工作，实用性更强。本发明检测靶点具有单一特异性，检测结果特异，易于判定。 

附图说明

图1为实施例中PCR检测方法特异性评估实验凝胶电泳结果图；

图2为实施例中PCR检测方法灵敏度评价实验凝胶电泳结果图；

图3为实施例中临床样品检测凝胶电泳结果图。 

具体实施方式