[发明专利]人工合成人肠激酶基因及其表达纯化方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体属于一种重组人肠激酶轻链（Human Enterokinaselight chain,hEK_L）的制备方法，包括其工程菌细胞的构建、重组人肠激酶的表达和纯化。

二、背景技术

利用融合表达往往能实现目的蛋白的高效表达及分离纯化。但有时目的蛋白不能以融合蛋白的形式使用，因此在目的蛋白与标签蛋白之间设计特异的蛋白酶酶切位点，融合蛋白经过特异性的切割或断裂，才得到完整的目的蛋白。目前常见的工具蛋白酶有凝血酶、肠激酶或Xa因子等，其中肠激酶特异性最好。

目前已经采用原核或真核表达系统成功得到了有生物活性的重组牛、小鼠等肠激酶轻链蛋白，但很少见关于人肠激酶轻链基因工程方面的研究。

肠激酶是哺乳动物十二指肠的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶，由一条重链(82-140kD)和一条轻链(35-62kD)组成，通过一对二硫键连接。重链起锚定肠道细胞膜、识别蛋白质的作用；轻链则有全酶催化活性，是该酶的催化亚基。人肠激酶(Human Enterokinase，hEK)除了含有以上两个亚基外，还包括一个迷你小亚基，为异源三聚体。主要特点是对Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-↓-X(↓表示切割位点，X代表任意氨基酸)序列具有很高的识别和切割特异性。由于肠激酶酶切反应条件相对温和宽泛，在pH值(4.5-9.5)及温度(4-45°C)均有良好酶切活性，因此成为融合蛋白表达体系中常用的切割工具。但是天然的人肠激酶不仅来源有限，而且成本高，得率低，也容易被其它蛋白酶污染，从而导致目的产物降解。因此运用基因工程的方法生产人肠激酶已成为趋势。

国内外已有大量关于牛肠激酶研究的报道，但有关人肠激酶研究还很少。有研究表明，人肠激酶的K_cat/K_m值约为牛肠激酶的10倍，具有更高的切割效率，因此，如果能利用基因工程方法得到重组人肠激酶，其应用价值将比重组牛肠激酶更高。目前，人肠激酶轻链在毕赤酵母中的重组表达为3.8mg/L，活力为Invitrogen商品化的肠激酶催化亚基产品EKMax^TM的3倍，而在大肠杆菌中的重组表达为包涵体，经变复性处理后每升发酵液可纯化得到10mg有活性的人肠激酶轻链蛋白，活力为EKMax^TM的5倍。由于肠激酶轻链含有9个Cys残基，其中形成4对二硫键，只有一个游离的Cys残基未参加配对，因此在重组表达时，极易形成二硫键错配，导致产物以包涵体形式出现。MBP已经被证实具有很强的助溶作用，可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。这一特点尤其适用于本实验hEK_L的表达与纯化。

三、发明内容

本发明的目的在于提供一种能在大肠杆菌中高效表达人肠激酶基因及其产物的表达纯化方法，该方法适合于人肠激酶的大规模制备。

本发明根据已报道（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的人肠激酶轻链的核苷酸序列和大肠杆菌偏爱密码子的使用原则，设计编码与人肠激酶轻链氨基酸序列一致的人肠激酶轻链的核苷酸序列，进行体外合成，在大肠杆菌中得到高效表达，并利用亲和纯化得到高活力的MBP-hEK_L融合蛋白。

本发明提供的一种人工合成的人肠激酶轻链（hEK_L）基因，它是序列表中SEQ NO 1的核苷酸序列。

一种表达载体，它含有SEQ NO 1的核苷酸序列，并含有Tac启动子。

一种工程菌，它含有上述的表达载体。所述工程菌是大肠杆菌。

一种人工合成人肠激酶轻链基因在大肠杆菌中的表达纯化方法，包括如下步骤：

(1)构建含有人工合成的hEK_L基因的重组质粒pMAL-s-hEK_L；

(2)将重组质粒pMAL-s-hEK_L转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株；

(3)将工程菌接种到LB培养基溶液中培养，当工程菌培养液浓度OD_600nm达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1-1.0mM的IPTG，37℃诱导表达3-7小时，离心收集菌体，超声破碎后离心，取上清，用Amylose亲和层析的方法纯化得到目的蛋白MBP-hEK_L。