[发明专利]一种猪蓝耳病基因重组猪霍乱沙门氏菌疫苗及应用

说明书

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（或称猪蓝耳病）修饰型ORF5m基因的重组猪霍乱沙门氏菌及疫苗的构建及应用。 

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种能够导致妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪呼吸道症状的病毒性传染病(Meulenberg et al,2000)，又称蓝耳病。该病以妊娠母猪早产、流产、产死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍，新生及断奶前仔猪高死亡率以及各年龄段尤其是仔猪的呼吸道疾病为特征。因其临床上常以感染猪只的可视黏膜例如耳部、吻突处发绀为特点，所以俗称“蓝耳病”(Blue-earDisease)。我国大陆于1996年首次报道此病并分离到病毒(郭宝清等，1996)，随后该病在我国呈蔓延趋势(蔡雪晖等，2000)。目前PRRS已遍及全球主要养猪国家和地区，成为影响养猪业的主要疾病因素之一，给养猪业造成了巨大的经济损失。2006年以来更是爆发了席卷全国的所谓“猪高热综合征”，又称“猪无名高热”，研究表明，肆虐我国养猪业的所谓“猪无名高热”与高致病性PRRSV感染有直接关系。 

GP5由ORF5编码，长度为200个氨基酸左右，分子量为25～30kD，为糖基化的囊膜蛋白。GP5可诱导产生特异性中和抗体(neutralizing antibodies,NA)，病毒中和效应与抗GP5抗体滴度呈显著正相关性。用含编码GP5的DNA疫苗免疫，可使免疫猪产生抗PRRSV的NA。也有研究表明，该蛋白可引起细胞凋亡(Osorio et al.,2002)。Ostrowski等(2002)用具有PRRSV中和性的单抗和猪血清，从PRRSV cDNA噬菌体文库中筛选出了2个针对B细胞的抗原位点，即A表位和B表位，它们均位于GP5上。研究证实位点A为非NE，在各PRRSV分离株中高度变异，具有免疫优势；位点B为NE，在各PRRSV分离株中相对保守，不具免疫优势。位点A可能扮演了一个诱骗因子的角色，抑制了B表位产生NA的能力，使NA的产生至少推迟了3周，所以在设计基于GP5的PRRSV疫苗时，应考虑将B表位充分展现出来。江云波等（2006）研究证实将PADRE插入ORF5基因的诱骗表位和中和表位间，可以使ORF5基因的NE充分展示给B细胞，从而增强NA产生的水平。因此，如果用修饰型ORF5m基因代替天然的ORF5基因，从而诱发更高免疫反应的优化的GP5蛋白，有望成为新一代疫苗研制的候选靶蛋白。 

同多数病毒性疾病的防制相同，对PRRS的防制仍以疫苗免疫预防为主。目前PRRS商品化疫苗主要是灭活苗和弱毒苗两种传统常规疫苗，使用后虽均可减轻临床症状，但不能阻止强毒感染和病猪的排毒及持续性感染的发生。 

（1）PRRS灭活苗：目前，世界上许多养猪国家都已研制生产出PRRS灭活疫苗。例如灭活苗“Cyblue”(西班牙Cyanamid公司产品)，是基于欧洲型分离株的油乳剂疫苗，我国的PRRSV灭活疫苗则是由中国农 业科学院哈尔滨兽医研究所研制的基于美洲型分离株CH1a株的油乳剂疫苗，用于预防母猪的繁殖障碍。灭活疫苗最大的优点是安全性好，最大的缺点是免疫次数多、免疫剂量大、免疫产生的保护效力有限。 

（2）PRRS弱毒苗：同PRRSV灭活苗一样，目前许多国家(包括美国、西班牙、荷兰等)均已研制出针对PRRS的弱毒苗并商品化。PRRS弱毒苗效果要明显好于灭活苗(Mengeling et al.,1999)。但由于弱毒苗存在毒力返强的风险，所以安全问题仍是猪场长期免疫PRRS弱毒苗最大的忧虑(Storgaard et al.,1999)。 

PRRSV不同分离株尤其是不同基因型（群）分离株在毒力、生物学特性、抗原性和遗传学特性上存在一定差异，因此利用单一PRRSV毒株制备的疫苗不能完全保护免疫猪免受异源毒株的感染，这给PRRS疫苗的研制带来很大困难，尤其是近年来免疫猪非典型性或急性PRRS的爆发更使人们质疑现有PRRS传统常规疫苗的免疫效果。因此近年国内外学者一致致力于PRRSV新型疫苗的研发，例如亚单位疫苗、核酸疫苗、感染性cDNA基因突变疫苗等，但是这些疫苗存在成本昂贵及技术要求高等缺陷，难以推广应用。