[发明专利]一种基于抗体定向固定和纳米复合材料免疫传感器制备方法

说明书

技术领域

本发明提供一种基于抗体定向固定和纳米复合材料的免疫传感器制备方法，属于生物传感器技术领域。

背景技术

近年来，农药残留引起的中毒事件屡屡发生，果蔬中的有害、剧毒农药的残留问题一直是人们关注的焦点，也是现今中国加入WTO后，农产品出口遭遇“绿色壁垒”的主要影响因素之一。克百威是氨基甲酸酯类杀虫剂主要品种之一，它作为一种光谱杀虫剂被广泛应用于当今农业中。该药剂具有内吸性，能通过根、茎、叶或种子吸收传导，并输送到植物体的各器官，也能通过径流渗透污染地下水。研究发现克百威的代谢物可引起细胞强烈的DNA单链断裂，具有明显的细胞毒性。虽然近年来国际上在蔬菜上已禁用该农药，但由于其对某些作物具有生长刺激作用，所以仍有不少违章使用现象。具有这样高毒性的农药残留超标的果蔬流入市场，必将会对人们健康造成严重危害，因此建立一种快速、灵敏、安全可靠的农药残留检测分析方法迫在眉睫。

传统的用于检测农药残留的分析方法有：气相色谱（GC）、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光分析、酶联免疫(ELISA)等，这些传统的方法虽然具有高选择性和灵敏度，但其受到样品前处理耗时、仪器设备昂贵、操作人员技术要求高、检测时间长等诸多因素的限制，只能局限于实验室操作，不能满足果蔬现场速测的要求。免疫传感器是根据抗原和抗体特异性结合所引发的免疫反应的原理研制成的传感器，与传统的分析方法相比,它具有特异性强、分析速度快、结构简单、成本低廉等优点。在电流型免疫传感器的制备过程中，抗体（Ab）或半抗原（hapten）的固定化并保持其良好的生物活性、空间排布以及信号的放大是制约传感器灵敏度、稳定性、选择性以及再生性能等的关键因素。

发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷、操作简单、灵敏度高，选择性好的检测农药残留的电流型免疫传感器的制备方法。

其技术方案为：一种基于抗体定向固定和纳米复合材料的免疫传感器制备方法，其特征在于：实现抗体定向固定，抗克百威的单克隆抗体（Ab）以谷胱甘肽（glutathione, G-SH）作为空间手臂被定向共价固定到纳米金胶表面。

所述的一种基于抗体定向固定和纳米复合材料的免疫传感器制备方法，其特征在于：分别制备多壁碳-壳聚糖（MWCNTs-CS）、石墨烯-聚乙烯亚胺-纳米金（GS-PEI-Au）两种纳米复合材料，并利用这两种纳米材料的协同作用共同修饰电极，以放大响应电流。

所述的一种基于抗体定向固定和纳米复合材料的免疫传感器制备方法，其特征在于：实验条件的优化，主要包括测试底液的pH、孵育温度以及孵育时间；所制备的免疫传感器的工作曲线为：%ΔI = 14.275 + 11.087 lgC (ng/mL)，(R²=0.9889.)，其检测限为0.03ng/mL；免疫传感器性能检测包括特异性、稳定性、重现性、再生性以及免疫传感器对多种果蔬样品回收率的测定。

其制备原理为：本发明采用谷胱甘肽（glutathione, G-SH）作为空间手臂将抗克百威的单克隆抗体（Ab）定向共价固定到纳米金胶表面，其中G-SH通过金硫键牢固的固定到纳米金胶表面，G-SH末端羧基（–COOH）经1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺（EDC）和1,6-己二胺（DAH）活化后，共价结合抗体C末端的–COOH，从而实现了Ab定向连接在纳米金胶表面。抗体的定向固定保持了抗体的生物活性以及自由的抗原结合位点来和农药有效的特异性结合。采用多壁碳-壳聚糖（MWCNTs-CS）、石墨烯-聚乙烯亚胺-纳米金（GS-PEI-Au）两种纳米复合材料共同修饰电极，显著的增强了电流响应，扩大了电极的有效固定面积，提高了电极表面抗体的有效固定量。将经过上述步骤修饰过的电极制成免疫传感器后，检测农药的精度更高、实现小型、便捷、适用于现场检测的目的。采用本发明制成的免疫传感器可以在蔬果采收、上市前，进行农药克百威残留的快速测定，直接对农药残留是否超标量进行检测，避免因食含有残留农药的蔬果而引起中毒，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种基于抗体定向固定和纳米复合材料的免疫传感器制备方法，其特征在于：⑴通过共价方法将抗体定向的固定在纳米金胶表面，抗体的定向固定保持了抗体的生物活性以及自由的抗原结合位点来和农药有效的特异性结合；⑵基于MWCNTs-CS和GS-PEI-Au两种纳米复合材料的协同作用，将其共同修饰电极。