[发明专利]一种乙酰木聚糖酯酶及其应用

说明书

技术领域

    本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中获得的新型酯酶及表达载体、重组酯酶及重组酯酶在水解短链脂肪酸脂、去酰基化反应及β-内酰胺类抗生素的重要中间体-去酰基化的7-氨基头孢烷酸及去酰基化头孢菌素C中的应用。 

背景技术

乙酰木聚糖酯酶（acetyl xylan esterase，缩写AXE）是一类可以将木聚糖或低聚木糖中的酰基化的吡喃木糖去酰基化并释放出醋酸的酯酶，分类于羧酸酯酶家族7，可以水解短链脂肪酸及各种酰基化化合物，具有广泛的底物特异性。 

现今，乙酰木聚糖酯酶表现出巨大的科研价值和工业应用价值，主要体现在以下两个方面。一方面，乙酰木聚糖酯酶在半纤维素木聚糖的降解中起重要作用。该酶与内切β-1，4-木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、α-L呋喃型阿拉伯糖苷酶及α-葡萄糖醛酸酶一起构成木聚糖降解酶系，能水解具有复杂结构的半纤维素木聚糖，使得开发和利用自然界中取之不尽的可再生资源成为可能，近些年获取高活力的乙酰基木聚糖酯酶及解析此酶的结构和功能已经成为研究的热点。另一方面，乙酰木聚糖酯酶具有良好的酰基酯酶活性，可以催化7-氨基头孢烷酸和头孢菌素C脱酰基合成β-内酰胺类抗生素母核，具有巨大的工业应用价值。β-内酰胺抗生素是抗生素中的最主要类型之一，全世界耗用量过万吨。目前使用的化学法存在成本高、三废污染严重等问题，很多制造领域已愈来愈趋向使用酶法合成。 

目前已知报道的生产乙酰木聚糖酯酶的芽孢类微生物有Bacillus pumilus、Bacillus subtilis ATCC6633、Bacillus subtilis168、Bacillus halodurans C-125等。其中，除Bacillus subtilis ATCC6633的乙酰木聚糖酯酶被报道具有较高pNPA酶活力（1580 U/mg）外，其他菌株的乙酰木糖酯酶的活力和性能仍然较差，限制了其在半纤维素降解和酶法合成β-内酰胺抗生素中广泛应用。因此，需要开发一种高活性的乙酰木聚糖酯酶，扩大其使用范围。 

发明内容

本发明的技术目的是提供一种新型的乙酰木聚糖酯酶的编码氨基酸序列及其对应的核苷酸序列。 

本发明的第二个技术目的是提供乙酰木聚糖酯酶的蛋白质结构，其中，以同源六聚体的活性最高。 

本发明的第三个技术目的是提供包括乙酰木聚糖酯酶的编码基因的表达载体。 

本发明的第四个技术目的是提供制备重组乙酰木聚糖酯酶的方法。 

本发明的第五个技术目的是提供重组乙酰木聚糖酯酶在水解短链脂肪酸脂、去酰基化反应、生产去酰基化的7-氨基头孢烷酸及去酰基化头孢菌素C中的应用。 

本发明通过以下技术方案来实现： 

本发明利用PCR技术从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出Cah基因，将Cah基因连在表达载体pET22b多克隆位点处，得到重组质粒pET-Cah，再将重组质粒pET-Cah转化E. coli BL21 (DE3)，得到重组的大肠杆菌，即产乙酰木聚糖酯酶的基因工程菌E. coli BL21-pET-Cah。

菌株培养后用IPTG诱导表达，产生重组乙酰木聚糖酯酶，对重组乙酰木聚糖酯酶分离即可。详细的操作过程见实施例1和实施例2。 

按照本发明的技术方案，可以达到良好的技术效果：