[发明专利]甘蔗褐锈病菌PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甘蔗病原菌的检测方法，具体涉及甘蔗褐锈病菌PCR检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

甘蔗褐锈病（Sugarcane brown rust disease）属真菌性病害，由属于黑顶柄锈菌的甘蔗褐锈病菌（Puccinia melanocephala）引起。该病主要由夏孢子传播，借风力附着在蔗叶表面，经气孔侵入。该病在美国、澳大利亚、印度和毛里求斯等国家普遍发生并多次爆发流行，不仅造成蔗茎产量损失，还对蔗糖分积累造成影响，影响程度因品种抗病性不同而有差异，严重时减产可高达40 %，并导致蔗糖分降低，幅度在10-36 %之间。

甘蔗褐锈病主要发生在叶片上，其发生与温度密切相关，16-22 ℃为发病最适宜温度。初次侵染源主要来自甘蔗本身或其他中间寄主。受褐锈病菌侵染后，初期甘蔗叶片上长出黄色小斑点，色泽呈褐色至橙褐色，周围有黄色晕环，后期病斑因夏孢子堆呈脓疱状，最后病斑变黑色，叶组织坏死，使甘蔗叶片失去光合能力，表现早衰。培育抗病品种，提高目标甘蔗品种的抗褐锈病性，并避免栽种感病品种，是控制甘蔗褐锈病的最经济有效的措施。在甘蔗抗褐锈病育种过程中，如何检测目标甘蔗品种中是否含有甘蔗褐锈病菌以及检测的的效率和准确性直接影响甘蔗抗褐锈病育种的进程和效果。目前，一般采取两种方法判断种茎是否带菌：一种是采用分离培养技术，在建立纯培养物的基础上，根据培养物所产生孢子的形态特征进行鉴定，黑顶柄锈菌夏孢子橙色或橙褐色，卵圆形至梨形，大小24.1～34.9×18.1～25.3 (μm)，具3～4个芽孔。夏孢子壁四周均匀加厚。冬孢子双细胞，壁光滑，顶壁常加厚，棍棒状，苍白至砖色，大小28.9～45.8×14.5～21.7 (μm)；另一种是基于该病害表型症状，因为甘蔗受褐锈病菌侵染后，病害症状表现为受侵染叶片出现褐色条纹病斑，叶片背面表皮破裂，产生锈色脓包，病情严重的叶片枯死，因此，可以采用种茎种植后，观察是否发生甘蔗褐锈病判断待检测甘蔗品种是否含有褐锈病菌。但是，上述的第一种方法由于分离培养以及最终建立纯培养物需要时间长，加上分离过程杂菌污染等，都会影响分离效果，检出效率不高；第二种方法则只有当甘蔗、环境条件和病原菌三个因素都具备，病害才能发生，换句话说，即便田间有病原、甘蔗基因型也是感病的，要发生病害，还需要合适的环境条件，三者缺一不可，因此，田间基于诱发的抗病性鉴定方法，鉴定结果难以预料。不同地点、不同年份间的鉴定结果有较大的差异，鉴定结果准确性不够，何况还需要长达几个月的漫长时间。显然，目前已有的技术方法，对于判断种茎是否带菌是不适用的，急需建立一种能够实现“快速”与“准确”目标要求的甘蔗褐锈病菌的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘蔗褐锈病菌PCR检测方法，可用于田间甘蔗褐锈病菌的早期诊断及检测。

    本发明的甘蔗褐锈病菌PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征在于： 

1、PCR检测体系的建立： PCR扩增体系为总体积25 μl，内含2.5 μl 10×PCR缓冲液，2.5 μl 25 mmol/L MgCl₂，0.5 μl 10 mmol/L dNTP，10 μmol/L 的检测引物PCR-F和PCR-R各1.0 μl，1.25 U Taq DNA Polymerase，20-30 ng基因组DNA，ddH₂O补足到25 μl； PCR扩增程序如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃8 min；所述10×PCR缓冲液组成成分为100 mmol/L pH8.5 Tris-HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl₂；

所述检测引物如下：     

PCR-F：5'-GAGCATCAAGGAAAGTAGCAATA-3'，

PCR-R：5'-GAAGATGGTTCGAGCCACAATTA-3′；           

2、PCR扩增产物的检测：琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为483 bp的位置出现DNA条带，为甘蔗褐锈病菌存在的标志。

本发明的应用效果：

本发明的甘蔗褐锈病菌PCR检测方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的根据病菌培养后的孢子形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定的方法相比，具有实用性好、准确性高和操作简便快速等优点。