[发明专利]一种无抗生素筛选标记在麻疯树基因转化中的应用方法

说明书

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种无抗生素筛选标记在麻疯树基因转化中的应用方法。 

背景技术

麻疯树是国际上研究最多的能生产生物柴油的能源植物之一，开展遗传转化能极大的促进麻疯树遗传育种的研究。鉴于麻疯树基因转化工作难度大，目前国内外关于这方面的报道还不是很多，而且已有研究用于麻疯树转化的选择标记系统都是采用潮霉素、卡拉霉素等抗生素或除草剂进行抗性筛选。这类药物对植株转化有较大影响，会影响转化细胞的生长及再生，尤其是像麻疯树这类的木本植物，采用传统的抗生素或除草剂等筛选方法获得转基因芽、再生根相当困难。另外，标记基因的安全性从一开始就受到了广泛争论。虽然也有不少手段可以去除转基因植物中的标记基因。但大多效率不高，或者需要进行子代杂交，这对木本植物来说不是十分现实。随着研究的不断深入，甘露糖筛选体系作为一种新型正向的筛选方法已受到了越来越多的人的关注。该体系是以大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因PMI为筛选标记基因，D-甘露糖为筛选剂进行筛选。1998年Joersbo小组报道了首例PMI转基因甜菜，随后对影响转化效率的因素作了大量的研究。虽然PMI/甘露糖筛选体系研究历史较短，仅有部分植物采用了该体系，但有由模式植物向经济作物发展的趋势。对一些难生根的作物，尤其是木本植物，相对抗生素筛选而言，甘露糖筛选对转基因芽生根能力的抑制要轻得多。2003年巴西的Boscariol等用带有PMI基因的农杆菌感染4种甜橙实生苗上胚轴，以甘露糖为碳源和筛选剂，其转化率在3%~23.8%之间，表明了该体系的有效性和安全性。 

虽然PMI/甘露糖筛选体目前已成功用于甜菜、拟南芥、玉米、小麦、水稻、大麦等多种植物转化，在木本植物甜橙和葡萄等上也有研究。但在麻疯树遗传转化中还尚未见报道。 

发明内容

本发明的目的是在于克服现有技术的不足，提供一种利用PMI（磷酸甘露糖异构酶）/甘露糖筛选体系在麻疯树基因转化中的应用方法，以提高麻疯树基因转化的效率。 

为达到以上目的，本发明的技术方案为： 

一种无抗生素筛选标记在麻疯树基因转化中的应用方法，依次包括以下步骤： 

1)克隆6磷酸-甘露糖异构酶基因（该基因序列在ncbi上面公开），构建甘露糖筛选标记的植物表达载体，并将载体导入农杆菌中； 

2）将经过预培养的麻疯树的叶盘外植体与农杆菌在感染培养基中感染转化，然后在共培养培养基中共培养，再依次转入筛选培养基、芽伸长培养基和生根培养基中进行培养，获得转基因植株。 

步骤1）所述的植物表达载体是双元载体pC1304PMI，（由6磷酸-甘露糖异构酶基因替换植物表达载体中的hpt基因）包含6磷酸-甘露糖异构酶基因和GUS报告基因。 

步骤2）中麻疯树的叶盘外植体预培养的培养基：MS培养基中含1mg/LTDZ,0.5mg/LIBA,1.5mg/L6-BA,2mg/LSNP；SNP是Sodium Nitroprusside（硝普钠），TDZ是一种细胞分裂素，全称是Thidiazuron。 

感染培养基：用MS液体培养基稀释农杆菌菌液30倍得到，附加0.02mmol/L乙酰丁香酮， 

共培养培养基：SR预培养基。 

步骤2）所述的筛选培养基：SR培养基中含10g/L蔗糖和20g/L甘露糖为糖源，附加500mg/L头孢霉素。 

步骤2）所述的芽伸长培养基：MS培养基中含0.1mg/L6-BA和0.005mg/LIBA，附加500mg/L头孢霉素； 

生根培养基：MS培养基中含0.3mg/LIBA，附加500mg/L头孢霉素。 

步骤2）中麻疯树的叶盘外植体的预培养过程如下：选取生长旺盛的麻疯树顶端幼嫩叶片，在无菌条件下用质量浓度20%的NaClO溶液（有效氯浓度为2%）消毒20分钟，无菌水洗涤三遍，切成大小为9mm²叶盘，近轴端朝上置于SR培养基中预培养14天，再进行感染转化。 

所述的感染培养基的制备过程如下：通过电转化法将载体pC1304PMI导入根癌农杆菌GV3101中，将转化细菌的单个菌落接种到含50mg/L卡拉霉素和50mg/L利福平的液体LB培养基中；在28℃下培养细菌生长直到OD600值达到0.6，得到农杆菌菌液，然后用MS 液体培养基稀释30倍，附加0.02mmol/L乙酰丁香酮，作为感染培养基。