[发明专利]叶片直接PCR法及其在转基因植物检测中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种PCR扩增方法及其应用，特别涉及一种以叶片直接作为模板进行PCR扩增的方法，以及该方法在转基因植物检测中的应用。

背景技术

目前，针对转基因植物检测的方法有很多种，主要基于不同检测目的，可分为以下几类：首先，检测目的为鉴定外源基因整合与否及其整合拷贝数时可使用常规PCR检测法、多重PCR法（Multiplex PCR，也称为MPCR）、降落PCR法（Touchdown PCR，TD-PCR）、反向PCR法（inverse PCR，IPCR）、以及Southern杂交检测法等等。其次，针对外源基因在转化植株中是否转录的检测与鉴定，可通过Northern杂交和实时定量PCR等方法进行检测。此外，检测与鉴定转基因植株外源基因表达情况时可使用Elisa检测和Westhern杂交等方法。其中常规PCR法以其快速、准确、可重复性高等特点已成为转基因检测中应用最为普遍的方法。

为了适应转基因技术的快速发展，提高检测检测效率，国内外都涌现出了大量基于PCR技术的检测方法，其中，武海斌（武海斌，路兴波，孙红炜等.转基因玉米转化体特异性PCR检测技术研究[J].玉米科学，2009,17(1)60-70.武海斌，孙红炜，李宝笃等.转基因玉米多重PCR-基因芯片联用的检测方法[J].农业生物技术学报，2009,17(6):1075-1082.）等建立了一种将多重PCR与基因芯片结合的检测方法，其特点在于较高的准确性和灵敏度。而金芜军（金芜军，郝旸，程红梅等.用复合PCR方法检测6种转基因玉米中外源DNA的特异性[J].农业生物技术学报，2005,13(5):562-567.）等则利用复合PCR的方法对不同转基因玉米中的外源DNA片段和玉米内参基因（zein）进行特异性检测。目前随着实验技术的发展，多种多样针对PCR实验革新使得PCR实验可实现简单快捷的规模化操作，大大节省了人力物力和时间成本。而在转基因植物检测过程中使用最为普遍的常规PCR法检测中制备DNA模板不仅是检测的第一步，也是保证检测结果准确与否的基础。目前主要使用CTAB法、SDS法等方法（Matsuoka T,Kuribara H,Akiyama H,et al.A multiplex PCR method of detecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize.Journal of Food and Hygiene Society of Japan,2001,42:24~32.）由待测样品中提取DNA作为PCR反应模板，这些方法操作复杂，提取时间较长，同时提取液中含有的苯酚，氯仿等试剂易对环境造成污染。在大规模检测中，DNA模板的提取已成为检测环节中耗时耗力最多的一个环节。特别是在转基因植物的回交转育过程中，需要进行大量的样本检测，而从田间取材获得的大量的叶片在长途的运输过程中要如何保证样品中的核酸不被降解，是一个相当棘手的问题，而往往消耗大量人力、物力和财力进行叶片的运输和保藏后进行检测的效果不尽理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种叶片直接PCR法及其在转基因植物检测中的应用。

本发明所提供的叶片直接PCR法是将植物叶片直接作为模板，采用Phire热启动II DNA聚合酶进行PCR扩增的方法。

在所述方法中，所述叶片可为幼嫩叶片。

在本发明的一个实施例中，所述幼嫩叶片具体为暗室中发芽的玉米黄化苗（苗高5~8cm），或大田中正常培育的玉米4-5叶期之前叶片，或番茄自种子萌发后第一片真叶出现至花蕾显现时的叶片。

为了达到更加理想的PCR效果，所述叶片在PCR反应体系中可以叶片面积小于等于0.2平方毫米的组织块的形式存在，足以保证有足够的叶片创面与PCR反应体系溶液充分接触。在本发明的一个实施例中，所述PCR反应体系中的所述叶片是用打孔器打出的直径为0.5mm的叶片组织块。

实际操作中，最好使所述叶片悬浮在所述PCR反应体系中，如果所述叶片贴壁则会影响PCR反应结果。