[发明专利]甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物原生质体的分离与纯化方法，具体涉及一种甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法，属生物技术领域。

背景技术

    植物原生质体克服了细胞壁这一屏障，是植物生理学、细胞生物学、体细胞遗传学等理论研究的理想材料，而且在基因工程及作物改良新品种培育方面有着重要应用前景。近年来，随着植物分子生物学发展，原生质体作为一个单细胞系统广泛地应用在基因定位、基因表达调控、RNA沉默机理、细胞钙信号转导及其调节机制等方面的研究。

甘蔗愈伤组织原生质体的研究始于上世纪70年代，原生质体分离、培养和植株再生也获得成功。但是，与模式植物烟草或拟南芥叶肉细胞原生质体研究相比，甘蔗愈伤组织原生质体分离纯化效果不尽理想，植株再生频率很低，直至今日没有长足发展。以甘蔗愈伤组织原生质体为受体材料，开展甘蔗转基因瞬时表达未见报道。本发明建立高效、快速的甘蔗愈伤组织原生质体的分离和纯化方法，获得高质量、高产量的原生质体可作为外源基因表达、启动子分析、基因沉默等转基因瞬时表达研究的受体材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、高效、简便的甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法，克服现有甘蔗愈伤组织原生质体分离和纯化方法存在质量和数量上的不足的问题，为甘蔗外源基因表达、启动子分析、基因沉默等转基因瞬时表达研究提供高质量、高产量的甘蔗愈伤组织原生质体。

本发明的目的是通过以下方法实现的。

    本发明的甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法，包括甘蔗愈伤组织培养、甘蔗悬浮细胞培养、甘蔗原生质体的分离和甘蔗原生质体的纯化；其特征在于操作步骤如下：

1、甘蔗愈伤组织培养

取消毒后的甘蔗心叶组织，无菌条件下切成1-2 cm厚的薄片，在MS3固体培养基上，28 ℃暗培养1-2个月，每隔2周继代1次；所述MS3固体培养基为：MS+0.5 g/L水解酪蛋白+3 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂粉；MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基（下同）；

2、甘蔗悬浮细胞培养

将甘蔗胚性愈伤组织捣碎后，在MS3液体培养基中，28 ℃暗培养2周，纱布过滤，滤液静置10-15 min，吸取底部胚性愈伤组织培养液，于恒温摇床震荡培养，转速120转/秒，28 ℃暗培养1-2月，每隔1周继代1次，直至悬浮细胞系出现；所述MS3液体培养基：MS+0.5 g/L水解酪蛋白+3 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖，去离子水补足1升；

3、甘蔗原生质体的分离    

取步骤2的新鲜悬浮细胞分装到50 mL离心管，100 g离心2 min；弃上清液，用酶解缓冲液清洗悬浮细胞后，100 g离心2 min；弃上清液，取悬浮细胞2-3克加入6孔的细胞培养板内，用3 mL酶解反应液酶解过夜，分离出甘蔗愈伤组织原生质体；所述酶解缓冲液：0.02 mol/L MES+0.4 mol/L甘露醇+0.02 mol/L氯化钾，pH 5.7；所述酶解反应液：2 %纤维素酶+0.1 %果胶酶+0.01 mol/L氯化钙+0.1 %牛血清蛋白，溶解于酶解缓冲液；在酶解反应液中，各原料所占的百分比为各原料与酶解缓冲液的重量百分比；

    4、甘蔗原生质体的纯化

用无菌水清洗70 μm 孔径的尼龙网，然后用W5溶液润洗，取步骤3获得的原生质体转移至10 mL离心管中，100 g离心2 min；弃上清液，冰浴的W5溶液悬浮原生质体，100 g离心1 min；弃上清液后即为纯化的甘蔗愈伤组织原生质体，在电子显微镜下观察，形态正常的原生质体量达10⁶个/mL；所述W5溶液：2 mmol/L MES+154 mmol/L 氯化纳+125 mmol/L 氯化钙+5 mmol/L 氯化钾，pH 5.7。

本发明还保护利用上述方法分离与纯化的甘蔗愈伤组织原生质体在甘蔗转基因瞬时表达中的应用。

本发明使用的所有化学试剂为分析纯。

    本发明的优点是，快速从甘蔗胚性愈伤组织培养获得悬浮细胞系，并通过酶消解后分离纯化获得质量高、数量足、均一性好的完整原生质体，为甘蔗外源基因表达、启动子分析、基因沉默等转基因瞬时表达研究提供理想的实验材料。

附图说明

图1是分离纯化后的甘蔗原生质体，标尺为0.2 μm。