[发明专利]基因共转染技术建立的白血病小鼠模型及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及ras突变体及AML1-ETO融合基因共转染骨髓细胞移植建立白血病小鼠模型及其制备方法。

背景技术

急性骨髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML），是一种骨髓造血前体细胞异常增殖的血液恶性肿瘤，是白血病的一种。其特点是骨髓中不成熟白血球剧增，使得骨髓无法制造健康的血细胞。AML是成年人最常见的急性白血病，其发病率随着人的年龄而增加。AML可以是原发性的，也可能是因为放射线暴露、致癌化学药物暴露造成。目前治疗方法主要以化疗法杀死恶性增殖的癌细胞为主，为了更好的为治疗提供新的策略，建立和人AML尽量接近的动物模型并以此研究确切的发病机制尤为迫切。

小鼠在遗传学与造血系统等方面和人类十分相似，因此建立小鼠白血病模型以研究人类白血病的细胞分子生物学特性、生化免疫特征、病理生理改变、发病机制以及药物治疗和预后具有重要意义。较为常用的C57BL小鼠对白血病因子较敏感，而对化学致癌物诱导作用敏感性低，但全身经放射线照射后，淋巴瘤发生率可达90%～100%。因此C57BL小鼠在评价特定基因或者基因突变在白血病发生中的作用尤其适合。

通过全身辐照后，结合骨髓移植的方法修改供体骨髓中的基因，使外源的基因得以表达并在后续观察其在白血病发病过程中的功能是新近出现的一种快速而便捷的探索新的基因和突变在AML发病中的方法，已经有报道成功的利用这个策略研究了例如N-ras，c-KIT等基因的突变对于AML的影响。

国内外的研究报道表明，N-ras^G12D突变比例高与白血病发病有较强的相关性，通过骨髓重建的小鼠模型验证发现N-ras^G12D突变确实可以显著的促进AML疾病发生及严重程度。K-ras基因是Ras家族的另一个重要成员，它与N-ras基因具有极高的同源性，并且有报道发现AML病人中也存在K-ras^G12D突变，这个突变发生的比例接近前者，但在AML发生中K-ras^G12D突变对于疾病的发生具有怎样的影响目前尚无报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因共转染技术建立的白血病小鼠模型，本发明的另一目的是提供该白血病小鼠模型的制备方法。

本发明所采用的技术方案是，提供一种通过对于K-ras基因进行定点突变，经过病毒包装后导入小鼠骨髓细胞中，而后与转染AML1-ETO融合基因的骨髓细胞应用尾静脉注射的方法共同移植建立白血病小鼠模型的方法注入C57BL小鼠体内，建立一种白血病小鼠模型。

本发明提供了一种白血病小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：

一、K-ras突变体及AML1-ETO融合基因慢病毒载体的构建

设计K-ras突变引物如下：

通过PCR扩增目的基因，回收、酶切、连接至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，进一步完成克隆筛选，测序正确后重新培养含有阳性目的克隆的菌液，提取质粒保存备用；

以Addgene公司购买的AML1-ETO融合基因的质粒为模板，引物设计如下：

PCR产生AML1-ETO（AML1/ETO）基因（基因序列参见文献：Chou FS,Wunderlich M,Griesinger A,Mulloy JC:N-Ras(G12D)induces features of stepwise transformation in preleukemic human umbilical cord blood cultures expressing the AML1-ETO fusion gene.Blood 2011,117(7):2237-2240.），将扩增的目的基因亚克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP病毒载体。

二、K-ras突变体及AML1-ETO融合基因慢病毒载体的包装