[发明专利]高温高效木糖发酵的耐热工程酵母菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及通过工程菌改造提高木糖发酵的领域。

背景技术

温室气体排放的增加和全球的温暖化、石油资源的枯竭和日益上涨的能源需求以及国家能源安全问题使得可再生能源的利用和开发是21世纪最重要的课题之一。其中从生物质生产燃料乙醇是其中重要的一个方向。木质纤维素类是地球上最丰富的可再生生物资源(每年约200X10⁹吨的产量)，中国每年约产生10亿吨农业和森林废弃物(Reddy and Yang，2005；Yinbo et al.，2006)，但是其中只有3％在非食品领域比如造纸和纸浆得到使用(Kamm and Kamm，2004)。

天然的木质纤维素类主要是植物纤维原料，主要成分含有40-50％的纤维素、20-30％的半纤维素，另外还有木素等组分。其中半纤维素主要成分是木聚糖，木聚糖的水解主要产物是木糖。

迄今为止发现很多种微生物能够代谢木糖产乙醇，包括细菌(Clostridia，Bacillus spp.等)、真菌(Mucor spp.，Rhizopus spp.，Monilia spp.，and Fusaria spp.Neurospora spp等)和酵母菌(Candida spp，Pichia spp，Kluyveromyces spp.等)。木糖的代谢和发酵都要将醛糖转化成酮糖再进入磷酸戊糖途径(PPP)，按照转化途径的不同可分为酵母等真核生物中的木糖还原氧化途径(即木糖还原酶(Xylose reductase(XR)、木糖醇脱氢酶(Xylitol dehydrogenase(XDH)及木酮糖激酶(Xylulokinase(XKS)的体系)和以细菌及一些低等真菌为主的木糖异构酶(Xylose isomerase(XI))的途径(图2)。

酵母中通过XR、XDH、XKS体系的木糖代谢和发酵已有很多文献报道。其代谢途径比葡萄糖代谢途径复杂得多，首先是在依赖NADPH的木糖还原酶(XR)的作用下还原木糖为木糖醇，随后在依赖NAD+的木糖醇脱氢酶(XDH)作用下氧化形成木酮糖，再经木酮糖激酶(XK)磷酸化形成5-磷酸木酮糖，由此进入磷酸戊糖途径(PPP)。PPP途径的中间产物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通过酵解途径形成丙酮酸。丙酮酸或是经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶产乙醇，或是在好氧条件下，最终通过三羧酸循环(TCA)及呼吸链彻底氧化成CO₂(Walfridsson et al.，1995)。目前已知至少22种酵母能转化D-木糖成乙醇，但是只有几种酵母菌(如：Brettanomyces naardenensis，休合塔假丝酵母(Candida shehatae)，Candida tenuis，嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)，Pichia segobiensis，树干毕赤酵母(Pichia stipitis))能产生较多的乙醇。其中研究较为深入的只有三种酵母，即休合塔假丝酵母、嗜鞣管囊酵母、树干毕赤酵母。但这些酵母的乙醇耐受性比较低，或者乙醇发酵能力还不够高，使它们的应用受到限制。

与之相对应，细菌和一些真菌通过木糖异构酶(XI)体系进行木糖代谢和发酵。与木糖的还原氧化体系不同，木糖异构酶体系通过异构酶将木糖直接变成木酮糖。在这个过程中无需辅酶来氧化还原，在厌氧条件下利用木糖不会产生还原力的不平衡(Hahn-Hagerdal et al.，2007)。这个体系主要存在细菌中，在少数低等真菌中也存在(Kuyper et al.，2003)。能够发酵木糖产乙醇的细菌有Bacillus macerans，Bacillus subtilis，Clostridium thermoaceticum等菌株。但这些细菌由于乙醇产率、乙醇耐受性、副产物及抗污染能力的问题，而在应用上受到限制。

由上所述，无论是酵母菌、细菌还是真菌，其野生型利用并发酵木糖生产乙醇能力均有限。