[发明专利]一种具有广泛宿主的穿梭表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有广泛宿主的穿梭表达载体。

背景技术

生物冶金是近二十年来冶金领域十分活跃的学科之一，已在铜、金、铀等金属的提取方面实现了工业应用。生物冶金是通过利用微生物的作用将金属矿物氧化、还原或络合分解，使金属离子进入溶液，进一步分离、富集、纯化而提取金属的技术。生物冶金与常规物理、化学选冶方法相比，具有过程简单、成本低、能耗低、对环境污染小等突出优点，特别适于贫矿、废矿、表外矿及难采、难选、难冶矿的堆浸和就地浸出。在当今资源需求量较大、易开发资源越来越紧缺、环保要求不断提高的情况下，微生物冶金技术的应用展现了特有的优越性和广阔的发展空间。

喜温嗜酸硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）广泛分布于硫化矿床、酸性矿水及土壤中，在细菌冶金、煤碳脱硫和含硫废水的处理、自然界的硫循环等方面发挥着重要作用。当它和铁氧化冶金微生物混合培养时，可以有效促进金属离子的溶出，从而提高冶金效率。因此，喜温嗜酸硫杆菌是一种重要的生物冶金微生物。但是在实际应用过程中，该菌存在生长缓慢、细胞得率低以及对冶金环境适应性差等缺点，严重限制了其应用范围。因此，要充分发挥喜温嗜酸硫杆菌在生物冶金的功能，对其进行遗传改造势在必行。

为实现对喜温嗜酸硫杆菌的深入研究和功能改造，构建一个稳定而有效的遗传操作系统的平台是非常必要的。现有技术中所用的遗传操作系统接合频率大多在10-4以下，影响了喜温嗜酸硫杆菌的遗传操作效率（特别是敲除质粒的效率），因此，开发一种高效的遗传操作系统是相关学者亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有广泛宿主的穿梭表达载体。

本发明提供了一种质粒，包括如下元件：复制原点oriV、复制蛋白Rep的编码基因、接合起点oriT、接合蛋白Mob的编码基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、供外源基因插入的多克隆酶切位点（MCS）以及转录终止序列。

所述复制原点oriV如序列表的序列1自5’末端第2041至2530位核苷酸所示。

所述接合起点oriT如序列表的序列1自5’末端第4234至4235位核苷酸所示。

所述复制蛋白Rep由复制蛋白RepA、复制蛋白RepB和复制蛋白RepC组成。所述复制蛋白RepC的编码基因的反向互补序列如序列表的序列1自5’末端第81至755位核苷酸所示。所述复制蛋白RepB的编码基因如序列表的序列1自5’末端第6337至7425位核苷酸所示。所述复制蛋白RepA的编码基因的反向互补序列如序列表的序列1自5’末端第946至1803位核苷酸所示。

所述接合蛋白Mob由接合蛋白MobE、接合蛋白MobD、结合蛋白MobC、结合蛋白MobB和结合蛋白MobA组成。所述接合蛋白MobE的编码基因的反向互补序列如序列表的序列1自5’末端第2461至3105位核苷酸所示。所述接合蛋白MobD的编码基因的反向互补序列如序列表的序列1自5’末端第3065至3748位核苷酸所示。所述结合蛋白MobC的编码基因的反向互补序列如序列表的序列1自5’末端第3761至4159位核苷酸所示。所述结合蛋白MobB的编码基因如序列表的序列1自5’末端第4227至4739位核苷酸所示。所述结合蛋白MobA的编码基因如序列表的序列1自5’末端第4897至7425位核苷酸所示。

所述启动子具体可为连四硫酸盐水解酶基因tetH的启动子。所述连四硫酸盐水解酶基因tetH的启动子如序列表的序列3自5’末端第76至156位核苷酸所示。

所述转录终止序列如序列表的序列5自5’末端第51至100位核苷酸所示。

所述多酶切克隆位点（MCS）具体可如序列表的序列4所示。

所述质粒还可包括一个以上的筛选基因。所述筛选基因可为卡那霉素抗性基因和/或链霉素筛选基因。所述卡那霉素抗性基因具体可如序列表的序列2自5’末端第469至1263位核苷酸所示。所述链霉素筛选基因（aadA基因）具体可如序列表的序列6自5’末端第132至950位核苷酸所示。

所述质粒具体可如序列表的序列7所示。

所述外源基因具体可如序列表的序列8所示。