[发明专利]纳他霉素的一种分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从发酵液中分离纯化纳他霉素的方法，属于工业微生物技术领域。

背景技术

纳他霉素是一种多烯烃，其分子是一种具有活性的环状四烯化合物，含3个以上的结晶水，其外观白色(或奶油色)，为无味的结晶粉末，分子式C₃₃H₄₇NO₁₃，分子量为665.73。纳他霉素是一种两性物质，分子中具有一个碱性基团和一个酸性基团，其结构上存在两种典型构型：烯醇式结构和酮式结构，这就决定了它在许多溶剂中的低溶解性。1981年，Brik指出：当室温条件下，纳他霉素在水中的溶解度为30～100mg/L，在水和较低级醇类中，随着pH值的升高与降低，纳他霉素的溶解性增加，在中性pH下溶解度最低，而在pH低于3或高于9时溶解度增大。

纳他霉素是一种高效、广谱的真菌抑制剂，其抗菌机理在于它能与细胞膜上的甾醇化合物反应，由此引发细胞膜结构改变而破裂，导致细胞内容物的渗漏，使细胞死亡。但细菌的细胞壁及细胞质膜不存在这些类甾醇化合物，所以纳他霉素对细菌没有作用。纳他霉素对几乎所有的霉菌和酵母具有抗性，是一种广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和某些藻类的多烯大环内酯类抗生素，但对细菌和病毒无效。

1972年，美国FDA建议纳他霉素作为食品添加剂使用的抗生素，还被归类为GRAS产品之列。我国1996年中食品添加剂委员会对纳他霉素进行评价并建议批准使用，现已列入食品添加剂使用标准，其商品名称为霉克(NatamaxinTM)。美国CFR编码：21CFR172.155，其中对纳他霉素的DAI值是0.3mg/kg，根据我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760)规定，食物中最大残留量是10mg/kg，而纳他霉素在实际应用中的使用量为10^-6数量级。

医学上的应用方面纳他霉素在治疗真菌引起的疾病方面也有良好的应用。最近纳他霉素在医学上特别是在眼角膜真菌感染方面的研究和报道层出不穷。它对口腔念球菌的感染有非常明显的治疗效果。另外也可应用于阴道及肺曲霉病的治疗。此外纳他霉素在青贮饲料方面以及作为抗真菌药物用于水果、种子马铃薯和水仙球茎都有良好的应用效果。

纳他霉素是通过发酵法制备的，产生菌一般为纳塔尔链霉菌、褐黄孢链霉菌等。纳他霉素在通常条件下不溶于水，常用一些有机溶剂进行提取，如美国专利3,892,850、W092/07998、W092/1058中均采取有机溶剂提取的方法。这些方法需要使用甲醇、异丙醇等易燃、易挥发的有机溶剂，势必导致较高的溶剂损耗、回收费用以及较高的安全设施要求、高昂的环保费用。而且甲醇的使用，容易导致纳他霉素甲酯这种副产物的产生，从而影响产品的纯度。WO97/29207公布了一种不需有机溶媒提取纳他霉素的方法，该方法先使用物理或化学的方法使发酵液中菌丝体细胞破碎、降解，发酵液中的纳他霉素固体悬浮在水相中，然后通过应用重力梯度离心技术使纳他霉素固体与细胞碎片分离得到产品。该方法具有工艺路线短的优点，但此工艺对发酵液中纳他霉素的含量要求较高(大于7g/L)，同时对发酵液中的纳他霉素晶体大小及均一度都有严格的要求。另外，此工艺对分离设备要求极高，同时需要高额的设备维护费用，因此该提取方法的应用具有一定的局限性。在中国国家专利CN101062934A中，公开了一种不使用有机溶剂从发酵液中提取纳他霉素的方法。该专利是利用那他霉素在不同pH条件下的水溶液中溶解度不同的性质，来实现那他霉素的提取。在其碱化过程中，发酵液的pH值均要求在11以上，这样势必使用大量的碱液来调节原本显酸性的发酵液。该方法虽然避免了有机溶剂使用，但大量酸碱的使用同样会带来不可预知的环保问题和酸碱的消耗、回收问题。另外，由于发酵液中纳他霉素的含量较低，这些方法在进行提取前都需要进行发酵液的浓缩处理，以提高提取得率及纯度，这样势必增加生产中的能耗。

发明内容

本发明的目的是提供一种从生物发酵液中提取纯化纳他霉素的工艺方法，以非有机溶媒法从发酵液中提取纳他霉素为特征，解决了有机溶媒法提取纳他霉素造成的纳他霉素提取纯化过程中有机溶媒损耗量高、工序长造成的生产成本较高的问题。

本发明的目的是通过以下技术措施实现的：

1、取10～40L的纳他霉素发酵液，用草酸调pH至2.8～3.0，依次加入黄血盐和硫酸锌，搅拌，处理约0.5h，再加入聚丙烯酸钠，温度控制在30℃以下，总处理时间不超过3h。

2、将处理好的纳他霉素发酵液在0.05～0.07Mpa压力下，经厢式隔膜压滤机过滤得澄清透明滤液，进行膜提取。