[发明专利]一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法

说明书

技术领域

本发明属于作物育种生物技术领域，尤其属于利用分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法。

背景技术

长豇豆是我国重要的夏季豆类蔬菜，深受人民群众喜爱。然而豇豆主要种植于夏秋高温干旱季节，全国范围内尤其是北方地区豇豆生产中面临着干旱的巨大威胁。干旱胁迫会造成豇豆大量落花落荚和形成“鼠尾化”豆荚，产量损失巨大，品质下降严重。当前广大豇豆种植者对耐旱性强的优良长豇豆品种的渴求非常迫切（Agbicodo et al., 2009）。因此，改良栽培长豇豆的耐旱性是我国长豇豆育种上亟待解决的重大问题之一。

但是植物包括豇豆的耐旱性属于受多基因控制的复杂性状，其育种改良较为困难。尽管可以通过田间或温室进行苗期或成株期的耐旱鉴定，但是该方法需要大量土地和人力资源，而且耗时费力，对于大量基因型材料的筛选很不现实。目前，豇豆的育种手段仍以常规育种为主。分子标记辅助选择（molecular marker-assisted selection，简称MAS）是现代分子生物学与传统遗传育种学相结合的技术。MAS借助分子标记对育种材料从DNA水平上进行选择，从而可以快速选择得到具有目的性状的后代(方宣钧等，2001)。通过追踪与耐旱基因关联的分子标记，不但能在遗传背景不同的育种分离后代中特异性检测目的基因是否存在，而且可以在任一生育阶段的同时对多个性状基因进行筛选。MAS方法迅速、稳定、可靠，不受其它效应和环境因素的影响，可使育种家摆脱对表型性状鉴定的依赖，在早世代进行选择，从而大大提高育种效率。应用MAS，理论上只要回交3代就可以选择到理想的材料。因此，研究开发实用性强、成本低、准确性高的与豇豆耐旱基因关联的分子标记，就可以显著加快豇豆耐旱育种速度，提高选择的效率和准确性，极具应用价值。

    近年来，国内外研究机构已在豇豆上开发了大量的SNP、SSR等标记，有力促进了豇豆分子育种工作（Xu et al., 2010）。SNP (single nucleotide polymorphism) 即单核苷酸多态性，是指在某种生物不同个体DNA序列中存在的单个核苷酸变异。SNP是基因组中最丰富的遗传多态，同时SNP也是最易进行自动化、高通量检测的标记之一。SNP技术已经大量成功地用于遗传多样性研究、遗传图谱构建、基因定位等研究。然而，由于SNP标记难于通过PCR检测，因此在育种实践中通常难于直接利用。当SNP的存在引起酶切位点改变时，通过在SNP位点两侧设计引物可将SNP转化为基于PCR的，使用较为方便的酶切扩增多态性序列标记（C1eaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS）。利用CAPS引物扩增目标基因片段，经相应限制性内切酶酶切后可以揭示原SNP位点的DNA多态性。利用由SNP转化的CAPS标记，育种家已在番茄、辣椒等蔬菜作物上成功进行了应用（李红等，2007；王立浩等，2006）。

发明内容

    本发明目的是：针对豇豆常规育种方法中单纯依靠田间或温室进行苗期或成株期耐旱鉴定所存在的需要大量土地和人力资源及耗时费力等的缺陷，提供一种省时、省力、准确、快捷的分子标记辅助豇豆耐旱品种的选育方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法，该方法按以下步骤进行：

    （1）豇豆耐旱关联SNP分子标记位点1_1286的筛选：用Qiagen公司的植物DNA小量提取试剂盒依说明书所述方法提取耐旱性程度各异的99份豇豆品系的DNA；利用豇豆 Kaspar SNP 基因型检测平台通过芯片杂交检测每份DNA上各1127个SNP位点的基因型，并按缺失信号率<20%，低丰度等位型即MAF值 < 0.1的标准去除低质量的SNP位点，最终保留422个SNP位点的基因型数据并被用于标记-性状关联分析；将上述422个SNP位点的基因型数据与同上所述99份豇豆品系历年温室耐旱性鉴定获得的茎杆绿色程度值Stg，按Tassel软件的MLM的混合线性模型进行关联分析，从中获得与Stg显著关联的P<0.001的SNP标记1_1286；上述温室耐旱性鉴定方法为：对发芽后正常生长20-24天开始甩蔓的植株终止浇水造成人工干旱胁迫，停水14天后对各份种质材料以其Stg即茎杆持绿色性为指标，按以下分级标准进行记载、统计：0级：茎杆正常，无失绿；1级：￡20%茎杆失绿；2级：20%-40%茎杆失绿；3级：40%-60%茎杆失绿；4级：60%-80%茎杆失绿；5级：>80%茎杆失绿至完全枯黄；