[发明专利]一种从植物提取物中筛选1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶抑制剂的方法

权利要求书

1.一种从植物提取物中筛选DXS酶抑制剂的方法，其特征在于：该方法包括以下环节：

(1)建立筛选反应体系：

采用D-甘油醛3-磷酸(D-GAP)或磷酸二羟丙酮(DHAP)作为底物，与二价金属离子和1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS酶)加入到缓冲液中，再加入所要检测的植物提取物样品，在25-45℃下孵育；所述二价金属阳离子为Mg²⁺、Mn²⁺、Co²⁺或Zn²⁺；然后加入磷酸酶，在30-45℃下孵肓，水解磷酸酯；然后加入色谱纯试剂和衍生化试剂进行衍生化；

(2)按照以上环节(1)建立对照反应体系：

采用D-甘油醛3-磷酸(D-GAP)或磷酸二羟丙酮(DHAP)作为底物，与二价金属离子和DXS酶加入到缓冲液中，在25-45℃下孵育；所述二价金属阳离子为Mg²⁺、Mn²⁺、Co²⁺或Zn²⁺；然后加入磷酸酶，在30-45℃下孵育，水解磷酸酯；然后加入色谱纯试剂和衍生化试剂进行衍生化；

(3)反相高效液相色谱检测

以环节(2)的对照样为参比，用HPLC方法检测环节(1)的样品中D-GAP或DHAP的转化情况：

采用的底物为D-GAP，则根据底物D-GAP的转化量或产物DHAP的生成量是否改变来判断所加样品对DXS酶活性有无影响；或者，采用的底物为DHAP，则根据底物DHAP的转化量或产物D-GAP的生成量是否改变来判断所加样品对DXS酶活性有无影响；

进而筛选出DXS酶的有效抑制剂。

2.根据权利要求1所述的从植物提取物中筛选DXS酶抑制剂的方法，其特征在于：

在环节(1)和(2)，加入的底物D-GAP或DHAP的浓度为2-10mM，二价金属阳离子的浓度为5-20mM，DXS酶用量为0.2-2mg/ml，所用缓冲液为40-400mM、pH＝5.0-9.0的Tris-HCl或PBS或柠檬酸或MOPS缓冲液；水解磷酸酯过程中加入的磷酸酶的用量为0.5-2units/μl，30-45℃下孵育时间为1-4h；

在环节(1)的筛选反应体系中，样品的终浓度为1-100μg/ml，25-45℃下孵肓时间为1-8h。

3.根据权利要求2所述的从植物提取物中筛选DXS酶抑制剂的方法，其特征在于：环节(1)和(2)的反应体系中，衍生化时加入的色谱纯试剂为甲醇，衍生化试剂为2，4-二硝基苯肼(2，4-DNPH)或3，5-二氨基苯甲酸(3，5-DABA)，浓度为50-120mM，孵肓温度为20-40℃，孵肓时间为0.5-2h。

4.根据权利要求3所述的从植物提取物中筛选DXS酶抑制剂的方法，其特征在于：环节(3)的检测体系中，高效液相色谱法所使用的仪器为Agilent Technologies1200系列或岛津高效液相色谱仪，色谱柱为4.6×250mm C-18低碳反相色谱柱，检测器为二极管阵列检测器；进样量为1-50μl；流速为0.3-2.0ml/min；检测波长为240-400nm；柱温为20-40℃；流动相为甲醇/水、乙腈/水或四氢呋喃/水，采用梯度洗脱模式，洗脱时间为15-30min。

5.根据权利要求4所述的从植物提取物中筛选DXS酶抑制剂的方法，其特征在于：

环节(3)采用甲醇/水作为流动相，则梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：甲醇；梯度为0min，40％流动相B；17min，80％流动相B；18min，40％流动相B；20min，40％流动相B；

或者，环节(3)采用乙腈/水作为流动相，则梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：乙腈；梯度为0min，40％流动相B；20min，80％流动相B；23min，40％流动相B；

或者，环节(3)采用四氢呋喃/水作为流动相，则梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：四氢呋喃；梯度为0min，35％流动相B；15min，60％流动相B；18min，35％流动相B；20min，35％流动相B。