[发明专利]虾夷扇贝铁蛋白基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于水产动物抗病基因筛选技术领域，具体涉及一种虾夷扇贝铁蛋白基因及其应用。

背景技术

研究表明铁蛋白是一种重要的免疫蛋白，在维持胞内铁离子平衡和先天免疫系统中起着重要作用。铁蛋白参与了海洋无脊椎动物的诸多重要生理过程，在炎症反应、铁离子吸收、去氧化解毒等方面均有重要作用。比如，海湾扇贝经鳗弧菌胁迫后，其体内铁蛋白水平有了明显提高；同样，太平洋白对虾经过白斑病毒感染后，铁蛋白基因也明显上调表达。此外，经金属离子及高温胁迫处理后，血蛤的铁蛋白也明显提高，以上研究表明铁蛋白在海洋无脊椎动物的先天免疫中起了重要作用。因此，筛选不同物种的铁蛋白，从而更准确的检测海水养殖物种的免疫系统具有重要的作用。

发明内容：

本发明的目的是提供一种虾夷扇贝铁蛋白基因及其应用，为贝类育种中病害防治提供技术手段，从而弥补现有技术的不足。

本发明的虾夷扇贝铁蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

上述虾夷扇贝铁蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明还涉及用于表达上述的虾夷扇贝铁蛋白基因的重组载体。

本发明的虾夷扇贝铁蛋白用于制备抗菌剂。

本发明克隆了虾夷扇贝铁蛋白基因，并对其体外重组表达产物进行了铁氧化和抑菌活性分析。研究表明本发明的虾夷扇贝铁蛋白不仅具有螯合铁的功能，而且具有抑菌活性，能够抑制贝类重要致病性细菌的生长。因此，虾夷扇贝铁蛋白在病害防治中具有良好的应用潜能。

附图说明

图1：本发明的虾夷扇贝铁蛋白基因的序列分析图；

其中长方形方框中的为铁反应元件IRE；实下划线aataaa为加尾信号;虚下划线为A + U不稳定元件；

图2：本发明的虾夷扇贝铁蛋白的立体结构图；

图3：本发明的虾夷扇贝铁蛋白重组表达后的电泳图；

图4：本发明的虾夷扇贝铁蛋白的铁氧化活性检测图；

图5：本发明的虾夷扇贝铁蛋白的抗菌活性图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：虾夷扇贝铁蛋白基因的分离及性质分析

本发明中的虾夷扇贝铁蛋白基因的cDNA序列克隆包括下列步骤：

a)虾夷扇贝总RNA提取；

b)虾夷扇贝5’ RACE和3’ RACE文库构建；

c)虾夷扇贝铁蛋白cDNA全长序列的获得；

d)目的基因的生物信息学分析。

具体操作如下：

a)虾夷扇贝总RNA的提取：按照trizol提取方法从虾夷扇贝肝胰腺中提取总RNA。

b)虾夷扇贝RACE文库构建：利用Clontech公司SMART RACE cDNA Amplification Kit构建5’ RACE和3’ RACE文库。

c)虾夷扇贝铁蛋白cDNA全长序列的获得：根据虾夷扇贝转录组文库中铁蛋白的部分序列信息，设计目的基因RACE引物，3’RACE引物：5’-ATGTTGAAACCGAGGCTGGAATCAACCG-3’和5’RACE引物：5’-GCATGTTCACGCTCTTCGTCAGACTTGGT-3’。分别利用3’ RACE引物和5’ RACE引物与接头引物NUP（5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'）进行3’末端和5’末端的扩增。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒（上海生工）进行PCR产物纯化，再与pMD18-T载体（大连宝生物工程有限公司）连接，参照《分子克隆第三版》（黄培堂译，科学出版社，2002年）的方法转化大肠杆菌DH5α。菌落PCR检测后，挑取阳性克隆进行测序，两端序列拼接后得到cDNA全长序列，为SEQ ID NO：2，其编码的蛋白序列为SEQ ID NO：2。

其中3’ 和5’末端扩增的条件如下：

50 μL反应体系：

扩增所用PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30sec，72℃3min，5个循环；94℃变性30sec，70℃退火30sec，72℃延伸3min，5个循环；94℃变性30sec，65℃退火30sec，72℃延伸3min，28个循环；72℃延伸10min。