[发明专利]壳聚糖-5’ppp-NS1shRNA纳米复合物的制备方法

说明书

技术领域

[0001] 本发明属于纳米分子的合成及基因工程技术，具体涉及到壳聚糖-5’ppp-NS1shRNA纳米复合物的制备方法。

背景技术

维甲酸诱导基因I(retinoic acid inducible gene I，RIG-I)为我国学者于1997年从人急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)NB4 细胞株中首次克隆。RIG-I作为胞质shRNA受体，通过其helicase结合shRNA和ATP，ATP水解致RIG-I-shRNA构象改变，暴露其CARD，与下游接头蛋白质干扰素启动子刺激因子-l(IPS-1)的CARD相互作用,下传信号，激活NF-KB和IRF等转录因子，诱导I型干扰素的表达和分泌，引发抗病毒天然免疫应答。但裸露的shRNA进人组织后迅速被组织内的RNase水解，因此需要构建一个能有效保护RNA并能被组织更好吸收的RNA运载体系。本专利采用分步法制备的RNA壳聚糖纳米粒，制备方法简单、可行，制剂稳定性，对包裹的RNA具有较好的保护作用。其实验结果显示壳聚糖与RNA形成表面带正电荷的纳米颗粒，使RNA被保护不受RNase的降解；壳聚糖-5’ppp-NS1shRNA纳米复合物能激活RIG-I，诱导I型干扰素的表达和分泌。5’ppp -NS1shRNA是流感病毒的RNA，壳聚糖-5’ppp -NS1shRNA纳米复合物的研制为进一步研究通用流感病毒疫苗奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种壳聚糖-5’ppp -NS1shRNA纳米复合物的制备方法。并公开壳聚糖-5’ppp  -NSshRNA纳米复合物作为制备基因药物载体方面的应用。本发明使用壳聚糖作为基因药物载体生物体内给药系统，取得了很好的效果。壳聚糖及其衍生物具有良好结黏附性，广泛用于靶向给药。壳聚糖及其衍生物和病毒外膜蛋白NS1 shRNA通过静电作用形成复合物，保护shRNA免于核酶降解、提高细胞摄取及胞内shRNA释放，已成功应用于shRNA的体内转染。

本发明利用壳聚糖作为载体，把流感病毒的NS1shRNA转染细胞中，进入细胞中的NS1shRNA被RIG-I所识别后，诱导RIG-I发生构象改变，暴露出原来隐蔽在蛋白质内部的CARD，以便与下游信号衔接蛋白VISA(又称为IPS1、MAVS或Cardif)的CARD结构域相互作用。VISA位于线粒体外膜，可通过细胞质内的TRAF3将RIG-I的激活信号传递给下游的TBK1和IKK蛋白激酶，导致IRF3/7和NF-kB的激活和干扰素基因的表达，引发抗病毒天然免疫应答。

壳聚糖-NS1shRNA纳米复合物的制备方法包括以下步骤：

第一步 壳聚糖纳米颗粒的制备方法：

壳聚糖，脱乙酰度＞85％，粘度≤100。本发明使用的药品全部是分析级试剂,所制备的纳米颗粒形态大多成球形，平均粒径约为480nm，多分散度< 0.25，zeta电位约为25 mV。

第二步 病毒外膜蛋白NS1基因的获得和5’ppp- shRNA的合成：

病毒的NS基因(890 bp)编码非结蛋白NS1、NS2。每个节段的两端具有末端重复序列，所有节段的3 端核苷酸序列相同。5 端有与3 端核苷酸序列互补的保守区段和重复序列。根据NCBI 登录的流感病毒A/PR/8/1934(H1N1)株的NS1基因，我们进行了设计，选取了其中21个碱基序列用于本实验的研究，碱基序列为： TGAGGATGTCAAAAATGCAGT。

委托鼎国生物公司合成了21个核苷酸的NS1shRNA，添加了5’ppp 的帽状结构。

第三步 壳聚糖-5’ppp-NS1shRNA纳米复合物的合成：

把壳聚糖纳米颗粒、5’ppp-NS1shRNA按质量比为1:5的比例混合，壳聚糖纳米颗粒带有正电荷， 5’ppp-NS1 shRNA带有负电荷，通过静电的作用形成壳聚糖-5’ppp-NS1shRNA纳米复合物；用5%琼脂糖凝胶电泳检测壳聚糖与5’ppp- NS1shRNA的结合情况。