[发明专利]一种从香鳞毛蕨中分离纯化四种间苯三酚类化合物的方法

权利要求书

1.本发明涉及一种从香鳞毛蕨中分离纯化四种间苯三酚类化合物的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)诱导：以干燥的香鳞毛蕨为原料，通过匀浆诱导技术和酶水解技术得到固体物质；

(2)提取：将诱导后的固体物质通过以乙醇为溶剂，采用超声波辅助、冷浸、负压空化、微波辅助的方法提取，诱导液及乙醇提取液合并浓缩后通过超声波振荡絮凝技术得到絮凝物，将絮凝物经负压空化混悬液固萃取技术萃取；

(3)分离：将萃取得到溶液浓缩后通过大孔吸附树脂柱色谱富集技术、凝胶分离技术及正相硅胶中压柱层析分离技术后得到绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB粗品；

(4)结晶：将绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB的粗制品经过低温析晶和重结晶技术得到纯度大于95％的纯品。

2.按照权利要求1步骤（1）所述的匀浆诱导技术，其特征在于：匀浆诱导所用的溶剂为水，温度30-50℃，体积为固体质量的3-6倍，连续匀浆诱导3次，每次5-15min。

3.按照权利要求1步骤（1）所述的酶水解技术，其特征在于：在提取过程中使用酶对新鲜或干燥的香磷毛蕨进行水解，将匀浆诱导后的浆液用柠檬酸、冰醋酸或盐酸调PH为3.0-6.0；取0.2-3％固形物重量的纤维素酶和果胶酶的复合酶，溶于pH为3.0-6.0的缓冲液中，在40-60℃水浴中激活8-15min，将激活后的复合酶缓冲液加入匀浆诱导浆液中，在温度为30-50℃的水浴中酶解3-5h。

4.按照权利要求1步骤（2）所述的乙醇提取液，其特征在于：乙醇提取液所提物质为匀浆诱导和酶水解后的固形物，提取方法为超声波辅助提取、冷浸提取、负压空化提取和微波辅助提取，所用溶剂为60-85％乙醇。

5.按照权利要求1步骤（2）所述的超声波振荡絮凝技术，其特征在于：将香鳞毛蕨乙醇提取物置于温度为40-50℃的水中，体积为提取物体积的6-8倍，超声波振荡絮凝时间为15-20min，频率为80-100kHz，静置时间为10-20min。

6.按照权利要求1步骤（2）所述的负压空化混悬液固萃取技术，其特征在于：对粘稠絮凝物进行负压空化混悬液固萃取，所用溶剂包括乙酸乙酯、正己烷、三氯甲烷和正丁醇，萃取所用的溶剂体积为提取物质量的0.05-0.1倍，萃取次数为3-5次，所用的压力为-0.05Mpa。

7.按照权利要求1步骤（3）所述的大孔吸附树脂柱色谱富集技术，其特征在于：将树脂填充到玻璃柱中，使之形成以树脂为填料的层析柱，所用树脂包括H1020、H103、D101、D3520、HPD-D、FL-3、AL-1、AB-8、HPD-826、HPD-600、NKA2或FL-1广谱性大孔吸附树脂，该方法操作步骤为：预先称取质量为样品量6-8倍的树脂，采用湿法装柱，保留液面，将负压空化混悬液固萃取所得到的固形物加入到乙醇中，充分搅拌溶解后，加入2-5倍量树脂，40-50℃条件下加热至乙醇挥干，样品完全吸附在树脂上，然后将拌样树脂加载到预置的树脂柱顶层，加入乙醇-水溶液梯度洗脱，具体包括用5-20BV体积分数10%-30%的乙醇溶液洗脱杂质，10-50BV体积分数50%-95%的乙醇溶液依次洗脱组份，收集洗脱液，浓缩至干。

8.按照权利要求1步骤（3）所述的凝胶分离技术，其特征在于：所用样品为树脂富集后所得固形物，所用凝胶为SephadexLH-20凝胶，将大孔吸附树脂富集的50%-95%部分分别浓缩，并将产物用2%-8%甲醇溶解，配制成料液浓度为5-20mg/mL的样品液，经0.45μm滤膜过滤后，按照100-150mg样品/mL凝胶，注入Sephadex LH-20凝胶柱，用水-甲醇体系梯度洗脱，先用20%甲醇2-5倍柱体积洗脱、然后用40%-70%甲醇3-7倍柱体积洗杂质、最后用80%-90%甲醇4-7倍柱体积洗脱，收集洗脱液。