[发明专利]一种植物维管组织特异表达启动子及其表达载体和应用

说明书

技术领域

本发明涉及杨树基因工程技术领域，具体涉及分离得到的杨树（Populus deltoides×P. euramericana cv.‘Nanlin895’）抗真菌蛋白基因类奇甜蛋白PeTLP2基因的启动子，其能够驱动一个多核苷酸序列或目的基因在植物细胞中高水平表达，并且在植物维管组织中特异表达。

背景技术

杨属（Populus）植物作为木本植物中的模式植物，具有优良的实验特性，包括：容易进行种间杂交和无性繁殖；生长迅速，并已建立完善的遗传转化体系；基因组相对较小，约450-550Mbp；易于进行遗传研究。因此，模式植物-杨树的基因表达调控的研究，为弄清木本植物的生长发育调控机理提供证据。

启动子是位于结构基因5’端上游的一段DNA序列，能与RNA聚合酶及转录因子特异结合，控制基因转录起始时间和表达的程度，是基因转录最主要的一种调节方式。启动子中包含多种重要的顺式作用元件，其类型直接影响着基因的表达量及表达位点。因此，启动子的分离与分析是研究基因表达调控的关键所在。

目前在植物表达载体中使用的大多为组成型的强启动子：来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actin启动子，花椰菜叶病毒CaMV 35S启动子和胭脂碱氨酸合成酶Nos启动子。组成型启动子可以使外源基因持续恒定的表达，但是外源基因的组成型表达不仅造成资源的浪费，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因还可能引起基因沉默或共抑制现象，此外还会引发转基因植物安全性问题，因此，有必要在杨树基因工程中采用组织器官特异性或逆境胁迫诱导型启动子，这样既可以是外源基因在杨树特异组织器官中或受到逆境胁迫时高效表达，又不影响植物体的正常生长发育。

目前，已经克隆的在杨树组织器官中特异表达或诱导型启动子还比较少。李强等分别从欧洲黑杨和美洲黑杨中克隆到机械损伤诱导表达-Win3基因启动子：WINP和WIDP，结果表明二者控制的GUS基因的表达不仅在损伤部位，还具有系统的因伤诱导效应。蒋浩等克隆到杨树树皮储藏蛋白BSP基因启动子，通过烟草转基因验证，该启动子具有韧皮部表达特性，介导GUS基因在转基因烟草韧皮部特异表达。张爽等从三倍体毛白杨-93中分离得到了MDCesAP这一木质部纤维素合酶基因启动子，结果表明MDCesAP为木质部特异性启动子。霍秀文等利用PCR方法从拟南芥基因组DNA中扩增得到了转录因子上游的DNA片段，初步表明该启动子为诱导型启动子。

随着杨树的广泛栽培，病害的发生越来越严重，在我国，主要的杨树病害有：叶锈病、杨树黑斑病、杨树炭疽病、白粉病、黑星病、溃疡病、烂皮病、枝瘤病、干腐病、紫根病等等，已严重威胁杨树的生长和木材质量，单纯依靠常规育种和喷洒农药的方法已不能从根本上解决问题。随着世界生态环境的日益加剧，以及地理和气候的限制，杨树抗性育种显得更加迫切。因此，寻找一周期短、效率高的新育种方法的工作已刻不容缓，并引起国内外林业研究者的普遍关注。

到目前为止，已经研究可用于林木抗真菌病基因工程的诱导型启动子几乎没有，因此，抗真菌基因启动子的研究对于杨树生长和木材质量的提高有着非常重要的作用。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种植物维管组织特异表达启动子，可用于杨树抗真菌病基因工程育种，可以驱动目的基因在植物细胞中高效表达，并且在植物维管组织中特异表达。本发明的另一目的是提供一种上述植物维管组织特异表达启动子的表达载体。本发明还有一目的是提供一种上述植物维管组织特异表达启动子的应用。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种植物维管组织特异表达启动子，核苷酸序列如SEQ NO1所示。

含有植物维管组织特异表达启动子的表达载体。

所述的表达载体为pJIT166-pPeTLP2-GFP融合表达载体和pBin-pPeTLP2-GUS融合表达载体。

所述表达载体中的GUS或GFP可以被多种目的基因取代，例如抗虫的Bt毒素蛋白基因和胰蛋白酶抑制剂CpTi基因。

所述的植物维管组织特异表达启动子在杨树维管组织中特异表达抑制真菌基因中的应用。

所述的表达载体在杨树维管组织中特异表达抑制真菌基因中的应用。

所述的植物维管组织特异表达启动子在培育抗真菌病杨树新品种中的应用。

所述的表达载体在培育抗真菌病杨树新品种中的应用。