[发明专利]一种近红外生物荧光染料在活细胞成像中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及活细胞与成像，提供一种近红外生物荧光染料在活细胞成像中的应用。

背景技术

随着生命科学研究的快速发展，生物荧光染料在细胞免疫学、分子生物学、分子遗传学等方面应用越来越广泛，已经成为生命科学研究的重要工具之一。

RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。常用的RNA成像方法有;带有荧光标记的RNA微注射，RNA原位荧光杂交，通过绿色荧光蛋白（GFP）或其衍生物YFP标记与RNA结合的蛋白或是有机染料小分子对RNA进行染色成像。目前商用的用于RNA染色的染料只有SYTO RNASelect一种，且其结构尚未公布。有机小分子荧光染料具有分子体积小，细胞通透性好，光稳定性好等特点。用于DNA染色的有机染料报道很多，但是RNA的却很少，这是由于有机染料对DNA双链结构的选择性要高于RNA的单链结构，所以RNA选择性染料的开发具有重要的应用价值。

线粒体是有氧呼吸产生能量的主要场所，能将细胞中的一些有机物当燃料，使这些与氧结合，经过复杂的过程，转变为二氧化碳和水，同时将有机物中的化学能释放出来，供细胞利用。由于线粒体的作用，生物组织内有机物能在氧的参与下转变成无机物，如二氧化碳和水，并为生物组织和细胞提供进行生命活动所需的能量或ATP。目前线粒体的荧光探针主要有：Mitotracker系列，JC-1,Rhodanmine 123,Rhodanmine 6G,DiOC7(3),Acridne orange-10nonyl bromide,DASPMI和DASPEI。

活细胞成像技术的发展有助于我们实时地研究细胞的生命活动，获取更具价值的细胞信息。用于活细胞成像的生物荧光染料很多，但是大部分这些荧光染料的吸收和发射都在400nm-600nm，发射在近红外区域（650nm~900nm）的染料很少。现有的染料在进行染色时，受背景荧光的干扰大。因此，需要对染料和染色过程进行改进，以便减弱背景荧光的干扰，使染色更彻底。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有荧光染料在进行染色时，受背景荧光的干扰大，染色不彻底等。本发明通过细胞培养、配制染料溶液、染色步骤，用近红外生物荧光染料将活细胞成像；本发明染色可以减少光源对细胞及组织的损伤，降低自发荧光的干扰，染色更彻底；本发明使用的一些近红外荧光染料对线粒体或者RNA染色具有特异性。

本发明提供一种近红外生物荧光染料在活细胞成像的应用，应用方法包括以下步骤：

1）细胞培养

将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养12~24h；其中，细胞培养液中含相应的培养基、10%体积百分数的胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素；

2）染料溶液的配制

将近红外生物荧光染料用二甲亚砜（DMSO）配成5mM~10mM的染料溶液；

3）染色

直接向原细胞培养液中加入步骤2）得到的染料溶液，摇匀，使近红外生物荧光染料的最终浓度为500nM~5μM，得到原细胞培养液和染料溶液的混合液，在37℃、5%CO₂、饱和湿度中孵育细胞10分钟以上，将线粒体或RNA染色；

4）成像

移去步骤3）的混合液，用磷酸盐缓冲溶液（PBS缓冲溶液）冲洗细胞2次以上，之后加入新鲜的细胞培养液，在活细胞工作站中保持37℃、5%CO₂、饱和湿度，用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像，激发波长为640nm；

其中，所述近红外生物荧光染料具有式（I）结构：