[发明专利]一种产碱性纤维素酶的铜绿假单胞菌

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和工程领域，特别涉及从自然界中纤维素丰富的环境中筛选、分离、纯化到一株能产生纤维素酶的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。 

技术背景

由植物(包括光合自养微生物)通过光合作用形成的有机碳化合物，除成型木材外，统称为植物生物质(biomass)。木质纤维(lignocellulose)是构成植物生物质的主要成分，也是目前公认的地球上资源量最大的可再生有机化合物资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素三大类组分构成，同时还可能含有少量的果胶、几丁质、硅酸盐等成分。纤维素是木质纤维中含量最高的组分，通常占总重量的35-45％，为一类由葡萄糖分子通过β-1，4糖苷键连接形成的线状多聚葡萄糖。这一结构与通过α-1，4糖苷键连接形成葡聚糖分子的淀粉类物质不同，因此不受淀粉水解酶类的水解。 

不过，由于纤维素的构成单元为葡萄糖，挖掘在温和条件下将其水解的生物酶制剂，无论是对该资源的开发，还是对纤维素加工产业(纺织、造纸等)的技术改进，都具有重要的意义。经多年的研究发现，按作用的最适pH条件划分，纤维素水解酶通常可分为酸性纤维素酶和碱性纤维素酶。 

酸性纤维素酶指作用的最佳pH条件在酸性范围的一类纤维素水解酶，目前发现的主要由一些丝状真菌，如木霉、根霉等微生物产生，通常含有三种酶活力组分：1、内切葡聚糖酶(endoglucanase)，即内切-β-1，4葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.4)，简称内切酶(EG或BGL)；2、外切葡聚糖酶，包括两类酶，一是β-1，4-D-葡萄糖-葡萄糖水解酶(EC 3.2.1.74)，也称纤维糊精酶。二是β-1，4-D-葡聚糖-纤维二糖水解酶，又称外切-β-1，4-葡聚糖酶(exo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.91)或纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH)，简称外切酶；3、β-1，4-葡萄糖苷酶(β-1，4-glucosidase，EC3.2.1.21)或β-葡萄糖苷-葡萄糖水解酶，简称β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，β-G)或纤维二糖酶(cellobiase，CB)等。这类纤维素酶通常能够将纤维素完全水解成游离的葡萄糖分子，因此也称为纤维素水解完全酶，现主要用于纤维素资源开发研究、饲料工业，以及纺织工业对棉料的表面处理。 

碱性纤维素酶则指在碱性条件下能够催化裂解纤维素分子的一类水解酶，最早在上世纪 70年代由日本科学家在嗜碱性的芽孢杆菌中发现。目前的研究表明，该类纤维素酶一般只有纤维素内切酶，即内切-β-1，4葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.4，简称内切酶，EG或BGL)的活性，活力用羧甲基纤维素(CMC)为底物测定，因此，也称为羧甲基纤维素酶(CMCase)。其活性通常以CMC活性单位表示。由于碱性纤维素酶的作用pH在碱性范围内，与纺织物洗涤条件比较一致，能够在温和条件下作用于污渍附着的位点，却不会对衣物造成损害，所以，该酶类产品目前主要用于洗涤工业，为加酶洗涤产品的必需原料。至今为止，能够产生碱性纤维素酶的微生物多为细菌菌株，包括芽孢梭菌属、纤维单胞菌属、纤维弧菌属、混合纤维弧菌、芽孢杆菌属等的一些菌种，以及牛黄瘤胃梭菌、白色瘤胃球菌、溶纤维菌，热纤梭菌、解纤维梭菌、粪碱纤维单胞菌等菌种，国外该类酶的工业化生产主要以芽孢杆菌属的菌株(如Bacillus sp.KSM-635)为发酵菌种。国内的研究受制于缺乏碱性纤维素酶的高产菌株，鲜有大规模的发酵生产，挖掘新的微生物产纤维素酶菌株仍极为必要。 

发明内容

本发明提供一株产生纤维素酶的微生物新菌株，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PKC-001。该菌株所产生的纤维素酶既有酸性纤维素酶的活力，也有碱性纤维素酶的活力，是一种新型的纤维素酶产酶菌株。该菌株是发明人用微生物学手段从造纸厂的废弃纸浆中分离选育得到，已于2010年11月8日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2010294。 

该菌株为短杆状，1.5μm×0.5μm，单生鞭毛，运动活跃。在平板培养基上显示为扁平、边缘锯齿的圆形菌落，色泽光亮。 

该菌株的最佳生长条件为：最适培养温度为37℃，高至42℃还可以生长；最适pH8.0，在7.5-12的碱性范围内均可生长，而在酸性条件下生长极慢。液体培养时接种量5％，转速为200rpm。培养8h左右进入对数期，32h后进入衰退期。