[发明专利]高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法

说明书

技术领域

 本发明涉及疾病检测技术领域，具体的说，是一种高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法。

背景技术

肠产毒性大肠杆菌(ETEC)性肠炎主要通过污染的水源、食品、牛奶、饮料等传播，产毒性大肠杆菌(ETEC)产生的毒素分为不耐热肠毒素(LT)和耐热肠毒素(ST)，根据其来源不同，耐热肠毒素又可分为猪源性(STp)和人源性(STa)，它们分别由位于质粒上的三种毒力基因编码，产毒性大肠杆菌(ETEC)一般含有三个毒力基因中的一个或几个基因。肠产毒性大肠杆菌（ETEC）检测以LT检测为主，但是约有5~10%肠产毒性大肠杆菌不具有LT基因，容易漏检，本发明提供高特异性检测STa基因的引物序列和方法，以提高肠产毒性大肠杆菌的检测率。

环介导等温扩增技术是由日本荣研（EIKEN）株式会社开发的高特异性敏感度的核酸检测系统，无须昂贵的设备，已经成为核酸快速检测法的良好手段，本发明结合环介导等温扩增技术，设计针对大肠杆菌O157特异性基因序列的一对外引物（ETEC-F3和ETEC-B3）和一对内引物（ETEC-FIP和ETEC-BIP）进行环介导等温扩增。

发明内容

本发明公开了一种高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，提高了肠产毒性大肠杆菌的检测和诊断效率。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，包括以下步骤：

步骤1）制备反应液

反应液组成及含量为

8u/ul Bst核酸聚合酶                         8u

10X耐热聚合酶反应缓冲液                 1X，MgSO4 2mM

4M 甜菜碱                                    1M

10mM d-NTP混合液                           400μM

内引物

   ETEC-FIP                                  40umol

   ETEC-BIP                                  40umol

外引物

    ETEC-F3                                   5umol

    ETEC-B3                                   5umol

标本核酸                                       20ng

添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul；

步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;

步骤3）使用大肠杆菌ETEC-STa+菌株，核酸STp+菌株，以及临床分离金黄色葡萄球菌以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，进行反应，观察它们的阴阳性。

进一步的，所述外引物ETEC-F3的序列为TTTGTCATGCAGCCCATC。

进一步的，所述外引物ETEC-B3的序列为TAGGTAGGTAGGTAGGTAGG。  

进一步的，所述内引物ETEC-FIP的序列为

CGACTGGATGACGTGATAAGTG-CTACATCTCACCTTTTTTAGACC。

进一步的，所述内引物ETEC-BIP的序列为TCAAAGGCTTTAAGACGTAGACTTT-GGTAGGTAACAACTCTCATTG。

进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。

本发明的有益效果是：

    本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测肠产毒性大肠杆菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。

具体实施方式

下面将结合实施例，来详细说明本发明。

 高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，包括以下步骤：

步骤1）制备反应液

反应液组成及含量为

8u/ul Bst核酸聚合酶                         8u