[发明专利]荧光标记多肽及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种荧光标记多肽，其氨基酸序列为TSRHK(Ac)-CONH₂，该氨基酸序列第五位赖氨酸残基上的乙酰基团可被组蛋白去乙酰化酶识别并切除。

2.如权利要求1所述的荧光标记多肽的制备方法，其特征在于：包括以下顺序进行的步骤：

A、取Fmoc-Lys(Ac)-Rink酰胺4-甲基二苯甲胺树脂(Fmoc-Lys(Ac)-RinkAmide-MBHAResin)置于反应容器中，以N，N-二甲基甲酰胺溶胀树脂，然后用脱保护液反应2次后，抽出脱保护液；

B、依次向反应容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-His(trt)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺，振荡反应；然后抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；

C、向反应容器中加入脱保护液反应2次，然后抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；

D、依次向反应容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；

E、向反应容器中加入脱保护液振荡反应2次，然后抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；

F、依次向反应容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(Boc)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；

G、向反应容器中加入脱保护液振荡反应2次，然后抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；

H、依次向反应容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Thr(tBu)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；

I、向反应容器中加入脱保护液振荡反应2次，然后抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；

J、依次向反应容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、5-FAM、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽出洗涤液，即得到存在于洗涤液中的荧光标记多肽，洗涤液中的荧光标记多肽再通过C18反相柱利用HPLC分离提纯得到荧光标记多肽产品。

3.根据权利2要求所述的荧光标记多肽的制备方法，其特征在于：所述的脱保护液为含有20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液。

4.如权利要求1所述的荧光标记多肽的应用，其特征在于：以所述荧光标记多肽为底物，筛选组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

5.如权利要求4所述的荧光标记多肽的应用，其特征在于，所述筛选组蛋白去乙酰化酶抑制剂的方法是：

1)将检测化合物用DMSO梯度稀释为化合物溶液；

2)在384孔微孔板中，每孔加入1微升梯度稀释后的化合物溶液；

3)每孔加入15微升含16微摩尔/升荧光标记多肽的反应缓冲液；

3)每孔加入15微升含去乙酰化酶的反应缓冲液；

4)放入30℃孵箱中反应60分钟；

5)每孔加入45微升反应终止液；

7)使用迁移率变动实验测量所述荧光标记多肽的转化率并计算检测化合物的半数抑制浓度IC50，如半数抑制浓度IC50小于1微摩尔/升，则所述检测化合物为组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

6.如权利要求5所述的荧光标记多肽的应用，其特征在于：所述化合物溶液的配制方法是，取浓度为10毫摩尔/升的检测化合物溶液，用DMSO按照半对数梯度稀释的方法稀释至所用终浓度的30倍浓度。

7.如权利要求5所述的荧光标记多肽的应用，其特征在于：所述反应缓冲液的配制方法是，取25毫升1摩尔/升的Tris溶液，137毫升1摩尔/升的氯化钠溶液，2.7毫升1摩尔/升的氯化钾溶液，1毫升1摩尔/升的氯化镁溶液，0.1克BSA粉末以及5毫升0.1摩尔/升的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液，加入蒸馏水定容至1升。