[发明专利]重组工程介导的定点突变方法

权利要求书

1. 一种基于重组工程的定点突变方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）通过重叠－延伸聚合酶链式反应获得一个DNA修饰片段， 所述DNA修饰片段依次由下列结构组成：与克隆在质粒上的待突变靶位点上游50bp序列一致的左端50bp同源臂、突变位点、靶基因突变位点的下游片段、与质粒所含的抗性基因不同的另外一个抗性基因和载体所含的抗性基因下游的50bp右端同源臂；

（2）将克隆靶基因的质粒转化基因染色体的重组工程菌株大肠埃希氏菌CGMCC No. 3192，大肠埃希氏菌CGMCC No. 3192含有受L-阿拉伯糖诱导表达的来源于从lambda噬菌体DNA的exo，bet和gam三个重组酶基因和来源于大肠杆菌的recA基因；

（3）将步骤（1）得到的DNA修饰片段电转化至以终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖诱导下表达Red 重组酶基因的步骤（2）的大肠杆菌电转化感受态细胞中，通过重组酶介导的同源臂和质粒上相同序列之间的同源重组，将所述DNA修饰片段中，左右50bp同源臂之间的片段取代质粒上两个同源臂之间的片段；直接获得靶位点发生定点突变，原质粒上的抗性基因被修饰片段做携带的抗性基因所取代的重组克隆。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于待突变位点和突变位点是一个或多个碱基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，首先通过一个聚合酶链式反应得到含与克隆在质粒上的待突变靶位点上游50bp序列一致的左端50bp同源臂、突变位点、靶基因突变位点的下游片段、与质粒所含的抗性基因不同的另外一个抗性基因和载体所含的抗性基因下游的50bp右端同源臂的融合DNA修饰片段。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，克隆有靶基因的质粒转化至基因染色体的重组工程菌株大肠埃希氏菌CGMCC No. 3192。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，同源臂用于通过重组酶催化的同源重组将含突变位点的DNA修饰片段取代质粒上两个同源臂之间的片段；靶位点发生突变，原质粒上的抗性基因被修饰片段做携带的抗性基因所取代，最终获得发生定点突变的重组克隆。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，重组酶基因是来自于lambda噬菌体的exo，bet和gam基因，来源于大肠杆菌的recA基因置于重组酶基因之下，重组酶基因和recA基因是克隆在受L-阿拉伯糖所诱导启动子之下，recA增加重组活性。