[发明专利]嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物与新医药技术领域。具体说是一种嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ的制备及其用他途。其制备涉及利用分子生物学技术将编码人凝血因子Ⅶ轻链（human factor VII light chain，hFVIIL）、CD8的跨膜区和胞内区及OX40和CD3ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列依次连接起来，得到编码嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ的融合基因片段，并在其5’末端插入信号肽Ig κ的编码序列。然后将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒。利用该慢病毒感染人T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。这种T细胞能够识别肿瘤细胞表面的组织因子，用于肿瘤治疗。

背景技术

嵌合抗原受体是模拟T细胞受体功能的人工受体，由抗原识别结构域（配体或单链抗体）和T细胞的一系列信号结构域依次连接而成。利用嵌合抗原受体修饰T细胞能够将配体或抗体的特异性识别作用与T细胞的效应功能联合起来，进行肿瘤靶向免疫治疗。此疗法是对人体自身T细胞加以改造后用于治疗，相对于放、化疗，其毒副作用较弱。由于嵌合抗原受体修饰的T细胞通过其抗原识别结构域识别肿瘤细胞表面抗原，然后启动杀伤作用，因此其治疗具有靶向性。由于该种T细胞通过其嵌合抗原受体直接识别肿瘤细胞表面抗原，然后通过其信号结构域直接将识别信号传递至胞内，激活T细胞的杀伤活性，因此可以绕开常规细胞免疫的主要组织相容复合体(MHC)限制性，从而有效克服肿瘤细胞MHC表达量低造成的免疫逃逸，并可以靶向非蛋白质肿瘤抗原。

组织因子（TF）高表达于多种恶性肿瘤细胞（肺癌、乳腺癌、肝癌等）及肿瘤血管内皮细胞，而在正常细胞及正常血管内皮细胞不表达或低表达。因此， TF是肿瘤靶向治疗的潜在位点。凝血因子Ⅶ是TF的天然配体，其与TF结合的亲和力（以Kd值表示）可达10^-12 M，而目前报道的抗TF抗体与TF的亲和力仅为10^-8-10^-9 M。正常生理情况下，活化的凝血因子Ⅶ由N端的轻链和C端的重链两部分构成，轻链主要负责受体结合活性，重链主要负责凝血酶活性。因此，人凝血因子Ⅶ轻链（human factor Ⅶ light chain，hFⅦL）可以作为针对组织因子的抗肿瘤药物的靶向载体。

嵌合抗原受体靶点识别结构域的灵活性及其与T细胞表面的空间距离，对于嵌合抗原受体修饰T细胞的特异杀伤活性至关重要。CD8是CD8⁺ T细胞表面的一个天然Marker，其hinge区是一个柔性区域。因此，其hinge区和跨膜区可以用来连接嵌合抗原受体的靶点识别结构域和胞内信号结构域。

CD3分子通过盐桥与T细胞受体（TCR）相连，其胞内段含有三个免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM），TCR识别并结合由MHC分子提呈的抗原肽后，导致CD3的ITAM的酪氨酸残基磷酸化，进而激活T细胞。因此，CD3分子是T细胞活化过程中的重要分子，其胞内结构域是T细胞活化所必需的。

OX40是T细胞的共刺激分子，它与T细胞中的受体结合后可以有效阻止T细胞的凋亡，增强细胞因子的生产，对维持T细胞的杀伤活性，提升T细胞的存活能力具有重要作用。因此，在嵌合抗原受体中加入共刺激分子OX40对于增强嵌合抗原受体修饰T细胞的存活能力，增强其肿瘤细胞杀伤活性具有重要作用。

发明内容

本发明提供一种嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ，它是一种融合蛋白。该嵌合抗原受体由人凝血因子Ⅶ轻链、CD8的hinge区和跨膜区及OX40和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。该嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。该嵌合抗原受体含有针对人组织因子的人凝血因子Ⅶ轻链，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。该嵌合抗原受体以CD8的hinge区和跨膜区及OX40和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

该嵌合抗原受体的编码基因能够被转移至T细胞内，用于修饰T细胞；利用该嵌合抗原受体修饰的T细胞，能够通过识别肿瘤细胞表面的组织因子，杀死肿瘤细胞，进行肿瘤治疗。